酶法水解乳清蛋白及其ACEI肽的研究

摘要

乳清蛋白是制备生物活性的肽的重要原料。水解乳清蛋白是获得抑制ACE活性肽的新途径之一。抗高血压生物活性肽具有较大的研究开发和应用价值。
　　 本论文以浓缩乳清蛋白为原料,研究了Alcalase碱性蛋白酶水解的最佳工艺,采用SAS软件设计并优化了工艺条件。得出最佳工艺条件为:pH8.5、反应温度55℃、酶底物比0.05。水解3.0h,得到水解度为19.34％的乳清蛋白水解物溶液。15L放大试验证明了该工艺条件的可靠性。
　　 采用G-25凝胶过滤层析法测定了乳清水解物及其超滤液的分子量分布范围。乳清蛋白水解物分子量分布是连续的,分子量大多集中在600-1400之间。采用了高效液相色谱.电喷雾.质谱(HPLC-ESI-MS)联用技术测定乳清蛋白水解物的分子量,水解产物主要集中在14个吸收峰内,测得乳清蛋白水解物分子量在(300-1400)Da之间,且大多数肽分布在1000Da以下。
　　 利用差示扫描量热分析,对乳清蛋白热力学性质、玻璃化转变温度和熔点等进行了研究,热变性温度的上升数据表明乳清蛋白水解物增加了热稳定性。
　　 本文采用ACE抑制活性体外实验模型,证明乳清蛋白水解物具有较强的降血压活性。采用超滤和层析柱分离ACE抑制肽,研究表明水解物经6 kDa的膜提取分离后IC50由原来的0.51mg/mL下降到0.47mg/mL,而水解物再经过层析柱分离后IC50由原来的0.51mg/mL下降到0.12mg/mL,层析样品具有最高的ACE抑制活性。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 乳清蛋白

1.1.1 乳清蛋白成分

1.1.2 乳清蛋白营养学简介

1.2 蛋白质和多肽分子量分布的研究进展

1.3 降血压肽的开发

1.3.1 肽链的长度

1.3.2 降血压肽的研究

1.3.3 降血压肽抑制活性的测定与评价方法

1.4 肽的生产方法

1.4.1 微生物发酵法

1.4.2 酶解法

1.4.3 化学水解法

1.4.4 提取法

1.4.5 化学合成法

1.5 研究目的和意义

1.6 研究的主要内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 原料与主要试剂

2.1.2 仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 蛋白质含量的测定

2.2.2 酶活力的测定

2.2.3 乳清蛋白酶水解物的制备

2.2.4 乳清蛋白的酶法水解工艺

2.2.5 蛋白质水解度的测定

2.2.6 肽链平均分子量的计算

2.2.7 分子量的测定

2.2.8 乳清肽的分离提取

2.2.9 影响乳清蛋白水解作用的因素

2.2.10蛋白酶水解乳清蛋白的条件优化

2.2.11灰分的测定

2.2.12水解液的脱盐处理

2.2.13浓缩

2.2.14冷冻干燥

2.2.15游离氨基酸的测定

2.2.16乳清肽生理活性的测定

2.2.17半抑制浓度的测定

2.2.18数据处理

3 结果与讨论

3.1 乳清蛋白水解工艺的研究

3.1.1 蛋白酶活力的测定

3.1.2 蛋白酶的选择

3.1.3 乳清蛋白的预处理

3.1.4 Alcalase蛋白酶水解条件的优化

3.1.5 酶水解进程参数的变化

3.2 乳清肽分子量分布的研究

3.2.1 标准物质的洗脱体积

3.2.2 G-25凝胶柱对多肽混合物分子量分布的分析

3.2.3 超滤液的分子量分布

3.2.4 LC-ESI-HPLC对乳清多肽混合物的分析

3.3 乳清蛋白水解物热稳定性分析

3.4 乳清肽的生理活性分析

3.4.1 水解过程中水解度和ACE抑制活性的变化

3.4.2 水解物IC50的测定

3.4.3 超滤液和层析液IC50的测定

3.5 ACEI肽产品

3.5.1 工艺流程

3.5.2 乳清蛋白水解物成品分析

4.结论

5.展望

6.致谢

7.参考文献

8.攻读硕士学位论文期间发表的论文