绿色荧光蛋白标记的豌豆根瘤菌的获得与功能分析

摘要

共生固氮在生物固氮中占有十分重要的地位。其中，主要的固氮共生体是农业上一类重要作物一豆科植物。根瘤菌(rhizobium)是与豆科植物共生、形成根瘤并固定空气中的氮素供植物营养的一类杆状细菌，这种共生体系具有很强的固氮能力。多数豆科植物根上形成具有固氮能力的根瘤，这是根瘤菌与豆科植物分子相互作用的结果。 根瘤菌对宿主豆科植物的侵染有一定的专一性，有的根瘤菌宿主范围窄，有的宿主范围广，根瘤菌进入豆科植物的主要方式是在根毛上形成侵入线。在土壤中根瘤菌与豆科植物相互识别，附着在宿主根毛上，使根毛卷曲，卷曲的根毛将根瘤菌包裹，其细胞壁内陷和伸长，逐渐形成一条管状的侵入线。侵入线不断伸长，到达皮层细胞，产生分枝，侵入线内的根瘤菌不断繁殖，并释放到皮层细胞，使其不断分裂，形成根瘤组织。根瘤菌在根瘤内分化成类菌体，并被宿主来源的膜(又称类菌体周膜)包围，类菌体将N2还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。但是根瘤菌感染根毛并通过侵入线进入根瘤的确切机制仍不清楚，其中，采用具有荧光标记的根瘤菌进行相关研究，将使研究结果变得具有直观性，能够促进相关研究得以更深入地进行。 GFP己证明是研究活体系统中的多种生物学过程的有利工具。自Chalfie等(1994)首次在大肠杆菌中克隆表达了的GFP以后。GFP作为一种新型的报告基因迅速引起全世界学者的极大兴趣。GFP作为一种新型的报告基因具有许多优越性：首先它分子量较小，只编码238个氨基酸的多肽，对细胞没有毒性，不干扰标记蛋白的功能和定位。另外，GFP能在异细胞内表达并自发产生荧光的蛋白，由于不需要辅助因子的参与，故可直接用于活体测定。可以说，GFP是当前研究活体细胞中基因表达和蛋白质分布的最好手段之一，具有广阔的应用前景。 本实验从豌豆根瘤菌gDNA中克隆到用于同源重组的DNA片段，获得了具有eGFP绿色荧光蛋白标记的工程豌豆根瘤菌，以期为今后开展根瘤菌与豆科植物根部或转结瘤素基因非豆科植物根部的相互识别、与结瘤素基因的互作、以及侵入线和根瘤形成等方面的研究奠定基础。主要实验结果如下： 1．从豌豆根瘤菌gDNA中克隆到用于同源重组的DNA片段。 进一步分析表明，RL—gDNA片段1的序列包含3个基因。结构表明，3个基因属于同一个操纵子单元。其中，阳离子转运蛋白基因的编码区得到完整克隆，通过序列分析比对，RL—gDNA片段l碱基序列的相似性程度(score)是332位、序列一致性的百分比(identity)为97％、氨基酸性质相似比(positives)为98％、比对时插入的空位比(gaps)为0％，选定该片段作为同源重组片段。 2．构建了带有豌豆根瘤菌gDNA同源重组片段和eGFP基因的原核表达载体。 3．获得了具有eGFP绿色荧光蛋白标记的工程豌豆根瘤菌成功构建了表达载体pVCT2123，并将其转入豌豆根瘤菌，获得了GFP标记的豌豆根瘤菌。 4．在豌豆上获得了具有eGFP绿色荧光蛋白标记的工程豌豆根瘤菌的根瘤。 利用具有eGFP绿色荧光标记的工程豌豆根瘤菌侵染豌豆幼根，获得了具有eGFP绿色荧光蛋白标记的工程豌豆根瘤菌的根瘤，检测结果表明具有eGFP绿色荧光标记的工程豌豆根瘤菌与豌豆形成根瘤。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

第一章文献综述

1.1豆科植物与根瘤菌共生固氮体系的研究进展

1.2报告基因在植物中的应用及研究进展

第二章引言

第三章材料与方法

3.1实验材料

3.2试验方法

第四章实验结果与分析

4.1豌豆根瘤菌gDNA片段的克隆与序列分析

4.2带有豌豆根瘤菌gDNA片段的eGFP原核表达载体pVCT2123的构建

4.3 GFP标记的工程豌豆根瘤菌的获得

4.4 GFP标记豌豆根瘤菌的功能验证

第五章讨论

5.1豌豆根瘤菌同源重组DNA片段的克隆

5.2 pVCT1237、pVCT1238、pVCT1239和pVCT1240同源性的比较

5.3豌豆根瘤菌表达载体的构建

5.4影响豌豆根瘤菌定植的因素

5.5后续研究

第六章结论

参考文献

致谢

附录 研究生期间发表的论文