重组CD13单链抗体/蝎毒素AGAP融合蛋白的原核表达及其对NB4细胞的作用

摘要

目的： 本研究应用基因工程技术方法，构建CD13单链抗体/蝎毒素AGAP融合基因的原核表达载体pRSETA/AGAP/CD13scFv，在原核表达系统内表达并纯化重组目的蛋白，并通过体外实验观察该重组蛋白对CD13阳性肿瘤细胞株NB4的作用。 方法： 1.构建pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/cD13scFv重组表达载体：利用RT-PCR法从东亚钳蝎尾腺中获得AGAP目的基因，用TA克隆法将目的基因连接至克隆载体PCR-TOPO，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定克隆载体PCR-TOPO/AGAP及测序进一步鉴定AGAP序列正确性；再经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后克隆至表达载体pRSETA，PCR初步鉴定重组表达载体pRSETA/AGAP，EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定pRSETA/AGAP，最后测序进一步鉴定pRSETA/AGAP序列的正确性；以质粒pSecTag2HygroC为模板，PCR反应扩增目的片段CD13scFv，将PCR产物胶回收纯化后进行测序鉴定CD13scFv序列的正确性，再经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至重组表达载体pRSETA/AGAP，PCR初步鉴定重组表达载体pRSETA/AGAP/CD13scFv，EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定pRSETA/AGAP/CD13scFv，最后测序进一步鉴定pRSETA/AGAP/CD13scFv序列的正确性。再用与pRSETA/AGAP同样的方法构建pRSETA/CD13scFv重组表达载体。 2.pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv重组表达载体在原核细胞内的表达、鉴定及纯化：将pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv重组表达载体转化JM109大肠杆菌，加用IPTG诱导表达，在大肠杆菌内表达CD13scFv/AGAP融合蛋白及CD13单链抗体蛋白，超声裂解细菌提取蛋白质，并进一步用ProBondTMNickel-Chelating Resin纯化柱结合并纯化融合蛋白CD13scFv/AGAP及CD13单链抗体蛋白，通过SDS-PAGE、Western Blot分析制备目的蛋白。 3.融合蛋白CD13scFv/AGAP在体外对CD13阳性肿瘤细胞株NB4的作用：将融合蛋白CD13scFv/AGAP与CD13阳性白血病细胞株NB4细胞共同培养，在显微镜下观察NB4细胞株生长状态；CCK-8检测融合蛋白对肿瘤细胞NB4的生长抑制率，并与对照组比较(Raji细胞组、CD13单链抗体蛋白组)抑制率；AnexinV法经流式细胞仪检测肿瘤细胞NB4的凋亡情况；PI染色法经流式细胞仪检测融合蛋白CD13scFv/AGAP对NB4白血病细胞株细胞周期的影响。 结果： 1、重组原核表达载体pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv经测序其目的片段分别与理论预计一致。 2、重组原核表达载体转化JM109大肠杆菌后，加入0.5mM IPTG37℃诱导4小时后，通过SDS-PAGE电泳、Werstern Blot分析外源蛋白的表达，表达产物即CD13scFv/AGAP融合蛋白、CD13单链抗体蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。 3、融合蛋白CD13scFv/AGAP在体外与CD13阳性的白血病细胞株NB4共同培养后，在显微镜下观察NB4细胞株碎片增加，数量明显减少；CCK-8显示不同浓度的融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NB4细胞后，能够明显抑制NB4细胞的生长，且其作用在一定范围内呈对浓度和时间的依赖性，其抑制率与对照组(Raji细胞组、CD13单链抗体蛋白组)相比明显提高(P<0.01)；流式细胞术分析显示融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NIM细胞后，凋亡率与对照组相比明显升高(P<0.01)；流式细胞术分析还显示融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NB4细胞后，细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.01)，阻止其进入S期及G2/M期。 结论： 1、通过分子克隆等技术成功构建了重组原核表达载体pRSETA/CD13scFv、pRSETA/AGAP/CD13scFv。 2、重组原核表达载体转化JM109大肠杆菌后，CD13单链抗体蛋白及CD13scFv/AGAP融合蛋白能够在原核细胞内成功表达。 3、融合蛋白CD13scFv/AGAP能够在体外更有效地特异性杀伤CD13阳性的NB4细胞。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

1.材料与方法

2.结果

4.分析与讨论

结论

参考文献

附录

致谢

综述 单链抗体的研究进展及在医学中的应用