黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗体1A7

摘要

本发明涉及黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗体1A7。该黄曲霉毒素阳性抗体基因库是将黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的混合轻链可变区基因和混合重链可变区基因采用重叠延伸PCR方法随机拼接得到单链抗体ScFv基因，然后与pCANTAB5E载体连接与转化得到的。该阳性基因库完全由对黄曲霉毒素具有识别能力的抗体的基因片段（阳性片段）构建组成；在相对库容量不大的情况下，可实现黄曲霉素素单链抗体的快速筛选；黄曲霉毒素重组单链抗体1A7为通用单克隆抗体，对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC

说明书

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗体1A7。 

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黄曲霉毒素B1被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即Ⅰ类致癌物质。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，在各种食物及农产品，尤其是玉米、花生及其制品中都很有可能存在黄曲霉毒素的污染。因此加强黄曲霉毒素的检测、特别是速测，及时了解和掌握各种食物及农产品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。 

现有黄曲霉毒素的检测方法包括化学分析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中化学分析法是早期检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素的抗体。 

随着抗体技术的发展，重组单链抗体在黄曲霉毒素的检测领域也逐渐被应用。与传统的多克隆抗体、单克隆抗体相比较而言，重组单链抗体具有其独特的优势，可以在原核表达体系里在很短的时间内大量生产并且生产费用低廉，对黄曲霉毒素的低成本、大规模检测有重要的应用价值，可以满足日益增长的黄曲霉毒素抗体的生产需要。而高质量的重组单链抗体通常需要从特定的噬菌体展示文库中筛选获得，通常文库库容越大，筛选到目的抗体的几率也就越高，但是文库构建的难度也相应增大。因此，在不增加文库构建难度的基础上通过阳性抗体库的构建将极大的提高特异性抗体的筛选概率。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗体1A7。 

黄曲霉毒素阳性抗体基因库，其特征在于：它是将黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的混合轻链可变区基因和混合重链可变区基因采用重叠延伸PCR方法随机拼接得到单链抗体ScFv基因，然后与pCANTAB 5E载体连接与转化得到的，所述的黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1分别由保藏编号为CCTCC NO: C201013，CCTCC NO: C201018，CCTCC NO: C201017，CCTCC NO: C201016，CCTCC NO: C201014的杂交瘤细胞株分泌产生。 

黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建方法具体如下：应用PCR方法分别扩增得到各黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的轻链可变区基因VH、重链可变区基因VL，将各抗体的轻、重链可变区基因等摩尔数混合作模板，然后利用重叠延伸PCR方法将两者与编码柔性短肽序列(Gly4Ser)3的Linker片段相连，拼接成单链抗体scFv基因，将构建的scFv基因与pCANTAB 5E载体连接与转化，构得黄曲霉毒素阳性抗体基因库。 

按上述方案，所述扩增得到其各黄曲霉毒素单克隆抗体的轻、重链可变区基因的引物为： 

重链可变区（Back）：5’- AGG TGC AGC TGC AGC AGT CTG G-3’

重链可变区（For）：5’- TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3’

轻链可变区（Back）：5’- GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’

轻链可变区（For）：5’- CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’。

按上述方案，所述重叠延伸PCR方法中扩增编码柔性短肽序列(Gly₄Ser)₃的linker片段的引物为： 

Linker正向：5’-TCC GGC GGT GGT GGC AGC GGT GGC GGC GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA -3’

Linker反向：5’-ACC GCT GCC ACC ACC GCC GGA GCC ACC GCC ACC TGA GGA TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT -3’。

按上述方案，所述在将轻链可变区基因V_H和重链可变区基因V_L与编码柔性短肽序列(Gly₄Ser)₃的Linker片段拼接完成后，根据pCANTAB 5E载体克隆位点附近序列设计在scFv基因两端分别引入载体pCANTAB 5E同源序列的引物，并使每条引物的末端至少包含15bp的载体pCANTAB 5E同源位点，以在scFv基因两端各引入至少15bp的载体pCANTAB 5E同源序列，所述引物如下： 

RS（Back）:  5’-TCC TTT CTA TGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA GGT GCA GCT GCA GC A GTC TGG-3’ 

RS（For）:   5’-CGG CGC ACC TGC GGC CGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’     

其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E同源的位点。 

按上述方案，所述单链抗体scFv基因的构建方法为：先在如下PCR扩增反应体系中： 

10× Ex taq Buffer           5μl

dNTP(2.5 mmol/L)         4μl

V_H 混合                 50ng

V_L 混合                 50ng 

Linker正向               1μl

Linker反向               1μl

Ex taq DNA 聚合酶       1μl

ddH2O  补至总体系      50μl；

PCR程序为：94℃ 1min、63℃ 4min，扩增7个循环；

然后在体系中补加下列物质进行扩增：

 10× Ex taq Buffer           5μl

dNTP(2.5 mmol/L)          4μl

RS（Back）               1μl

RS（For）                1μl

Ex taq DNA 聚合酶        1μl

ddH2O   补至总体系      50μl；

扩增程序为：94℃ 1min、56℃ 2min、72℃ 2min，扩增30个循环。

按上述方案，所述ScFv基因与pCANTAB 5 E载体的连接方法为：将pCANTAB 5 E载体经SfiⅠ/NotⅠ双酶切处理，然后与ScFv基因进行In-fusion连接；所述的转化为：将前述连接产物加入到大肠杆菌TG1电转化感受态细胞中，混匀，电转化，电转化条件：0.1 cm 电转化杯，1.8 kV，200 Ω，25 μF，电转化后立即在电转化杯中加入2YT 液体培养基吹打后转移，37℃缓慢振摇复苏1 h。 

上述黄曲霉毒素阳性抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素单链抗体的应用。 

按上述方案，上述噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素单链抗体具体通过如下技术方案实现：将构建成功的黄曲霉毒素阳性抗体基因库通过M13KO7辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过两步法进行筛选：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，最终筛选获得黄曲霉毒素重组单链抗体。 

黄曲霉毒素重组单链抗体1A7，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。 

按上述方案，所述黄曲霉毒素重组单链抗体1A7的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示，其中重链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。 

本发明的有益效果在于： 

（1）本发明提供的黄曲霉毒素阳性抗体基因库（简称阳性基因库）完全由对黄曲霉毒素具有识别能力的抗体的基因片段（阳性片段）构建组成，理论上，这些阳性片段同源重组所获得的单链抗体也会对黄曲霉毒素具有识别能力；

（2）在相对库容量不大的情况下，可以在满足黄曲霉毒素单链抗体筛选要求的前提下实现黄曲霉素素单链抗体的快速筛选；

（3）本发明提供的黄曲霉毒素重组单链抗体1A7为通用单克隆抗体，对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC₅₀ 为20 pg/mL，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为100%、166%、100%、0.1%和11.1%。

附图说明

图1为本实施例中scFv基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。图中，M：DNA Marker。 

具体实施方式

实施例1 下述所用抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1分别是采用保藏编号为CCTCC NO：C201013、CCTCC NO: C201018、CCTCC NO: C201017、CCTCC NO: C201016、CCTCC NO: C201014的杂交瘤细胞株1C11、2C9、1C8、10G4、3G1，分别根据专利申请号为CN2010102450955、CN2011101082306、CN 2012101176204、CN2012101176149、CN201210117612X的专利中报道的方法预先制得。具体制备方法如下：相应用各杂交瘤细胞株注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得各抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1，将抗体置-20℃冰箱中备用； 

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸，加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建 

1. 黄曲霉毒素阳性抗体基因库构建中所需引物的合成

（1）单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的重、轻链可变区基因序列扩增所需的引物：

重链可变区（Back）：5’- AGG TGC AGC TGC AGC AGT CTG G-3’

重链可变区（For）：5’- TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3’

轻链可变区（Back）：5’- GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’

轻链可变区（For）：5’- CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’

(2)扩增连接重、轻链可变区基因序列的连接肽（编码柔性短肽序列(Gly₄Ser)₃）的linker引物：

Linker正向引物：5’-TCC GGC GGT GGT GGC AGC GGT GGC GGC GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA -3’

Linker反向引物：5’-ACC GCT GCC ACC ACC GCC GGA GCC ACC GCC ACC TGA GGA TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT -3’

(3)在scFv基因片段的两端扩增至少包含15bp的载体pCANTAB 5E同源序列的引物RS Back/For；

RS（Back）：5’-TCC TTT CTA TGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA GGT GCA GCT GCA GC A GTC TGG-3’ 

RS（For）：5’-CGG CGC ACC TGC GGC CGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’     

其中：划横线部分表示与噬菌体载体pCANTAB 5E同源位点；

2. 各单克隆抗体重、轻链可变区基因片段的获得及定量：

（1）提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的总RNA；

（2）合成cDNA：以步骤1获得的各杂交瘤细胞株系的总RNA 为模板，oligo (dT) ₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2 Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo (dT) ₁₅ 由Invitrogen购得；

（3）PCR法克隆可变区基因：以各杂交瘤细胞株系的cDNA为模板，分别相应取各cDNA第一链反应物2μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTP (2.5mmol/L) 4μl，VH(或VL) (Back)引物(10μmol/L)1μl，VH(或VL) (For)引物(10μmol/L)1μl，无菌纯水37μl至50μl，涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应条件为94℃变性2min，加入0.5μl Pyrobest DNA酶后，94℃变性30s，55℃（如果扩增轻链可变区退火温度改为60℃）退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。PCR 产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段。

（4）制备1.0%的琼脂糖凝胶，将克隆得到的1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的轻、重链可变区基因分别各取2μl加入到3μl TE缓冲液中，并各加入1μl 6×loading buffer，混匀备用；将上述所有准备好的样品依次上样到琼脂糖凝胶上，同时在中间的两个泳道分别加入DL2000 DNA marker 125ng和250ng，电泳直至溴酚蓝迁移至凝胶的2/3处，EB染色后，凝胶成像系统成像，充分曝光使不同抗体可变区基因片段及DNA marker均清晰可见，然后通过与不同浓度DL2000 DNA marker染色强度的比较，估算得到每个抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段确切的量，根据估算结果，将各抗体的轻、重链可变区基因各取50ng分别对应加入到两个EP管中，分别标记为轻链可变区基因V_H混合与重链可变区基因V_L混合，作为下一步PCR反应的混合模板。 

3. 轻、重链可变区基因的混合连接及scFv基因的构建 

使用重叠延伸( splicing by overlap extension , SOE) PCR的方法将抗体重链可变区基因混合物与抗体轻链可变区基因混合物随机组合拼接，并引入连接肽(Linker) 编码序列（(Gly₄Ser)₃），以完成scFv基因的构建。另，为了便于下一步文库的构建，还在拼接完成后的scFv片段两端各加入至少15bp的载体pCANTAB 5E同源序列。具体方法如下：

PCR体系如下：

10× Ex taq Buffer           5μl

dNTP(2.5 mmol/L)         4μl

V_H 混合                 50ng

V_L 混合                 50ng 

Linker正向              1μl

Linker反向              1μl

Ex taq DNA 聚合酶       1μl

ddH2O  补至总体系      50μl

PCR程序为：94℃ 1min、63℃ 4min，共扩增7个循环，以完成scFv基因的构建；

然后在体系中补加如下物质：

10× Ex taq Buffer           5μl

dNTP(2.5 mmol/L)          4μl

RS（Back）               1μl

RS（For）                1μl

Ex taq DNA 聚合酶        1μl

ddH2O   补至总体系      50μl

PCR程序为：94℃ 1min、56℃ 2min、72℃ 2min，再扩增30个循环，以在scFv基因片段两端各引入至少包含15bp的载体pCANTAB 5 E同源序列。

反应完毕后，取出2μl PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测确认得到目的大小为750bp的拼接DNA片段，见图1。 

为了获得更多的多样性，将V_H混合EP管与V_L混合EP管中的样品分批全部进行PCR扩增，反应体系与反应条件同上。扩增完成后，将所有扩增产物用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。 

4. scFv混合片段与双酶切处理的pCANTAB 5 E载体的连接 

（1）双酶切处理pCANTAB 5 E：

SfiⅠ单酶切：

按照如下体系配制反应液：    pCANTAB 5 E vector      30μl

SfiⅠ               1μl

10×M Buffer              10μl

ddH₂O 补至总体系       100μl

50℃水浴2 h 后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。

NotⅠ酶切： 

按照如下体系配制反应液：    pCANTAB 5 E SfiⅠ单酶切回收产物      30μl

NotⅠⅠ                         1μl

10×H Buffer                           10μl

ddH₂O 补至总体系                    100μl

37℃水浴4 h 后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收；

（2）按照如下体系进行In-Fusion连接：

SfiⅠ/NotⅠ双酶切处理的pCANTAB 5 E vector     120ng

scFv混合片段               40ng

5×In-Fusion buffer           2μl

In-Fusion Enzyme            1μl

ddH₂O补至总体系           10μl

37℃水浴15min后，放入50℃水浴15min，水浴后立即放在冰上5min, 加入40μl TE缓冲液，混匀后-20℃保存待用。

5. scFv混合片段与pCANTAB 5 E载体的连接物的电转化 

将scFv混合片段与pCANTAB 5 E载体的连接产物取 5μl加入到50μl E. coli TG1电转化感受态细胞中，混匀后，加入到预冷的 0.1 cm 电转化杯 (Bio-RAD) 中，冰上放置10min，然后放在 Bio-rad 电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8 kV, 200 Ω, 25 μF，电转化后立即在电转化杯中加入0.5 mL 2YT 液体培养基吹打后转移至一灭菌后的干净1.5 mL EP管中，37℃缓慢振摇复苏1 h。

为保证库容量，将用于建库的样品采用如上电转化方法在同样的电转化条件下分批进行电转化，以将样品全部电转化。电转化完毕后，可将电转化得到的样品全部涂布数块SOBAG平板，30℃恒温培养箱中倒置培养过夜，次日将样品平板上长出的菌苔刮下，加入甘油后，-70℃保存备用。 

实施例2：利用上述黄曲霉毒素阳性抗体基因库筛选黄曲霉毒素重组单链抗体、获得的黄曲霉毒素重组单链抗体1A7、特性鉴定及其应用 

1. 黄曲霉毒素重组单链抗体的筛选

（1）黄曲霉毒素阳性抗体基因库的拯救：

将构建好的噬菌体展示黄曲霉毒素阳性抗体基因库的菌液稀释后涂布SOBAG平板，30℃恒温培养箱中倒置培养过夜；次日，将平板上单菌落随机挑取于96孔细菌培养板中，每孔加入200μl 2YT-AG，225 rpm，30℃培养过夜，此板标记为master plate，并将其置于96孔细菌培养板垫有湿滤纸的盒子中保湿；次日，准备另一块新的96孔板，里面加入事先加好2.5×10¹⁰pfu的M13KO7辅助噬菌体的2YT-AG培养基，每孔180μl，此板编号为plate P1，然后在master plate中每孔取20 μl过夜培养的菌液加入到plate P1的对应孔中，37℃，150 rpm 缓慢轻摇2 h，此时菌液应该变浑浊，然后1500rpm离心20 min，用枪头小心吸去培养基上清，每孔加入200 μl 2YT-AK培养基（100 μg/ml氨苄青霉素；50 μg/ml卡那霉素）重悬菌体沉淀，250 rpm 37℃培养过夜；次日，将plate P1以1500 rpm离心20 min，上清转移至新的96孔细菌培养板中，4℃保存备用。

(2) 黄曲霉毒素重组单链抗体的筛选： 

用AFB1-BSA（400ng/孔）及BSA（400ng/孔）（用作阴性对照）分别包被ELISA 板，4℃过夜；次日，倾掉包被液后，PBST 洗板3 次，然后用4％ PBSTM 封闭1 h；PBST洗板3 次，每孔加入上述步骤（1）中黄曲霉毒素阳性抗体基因库的拯救中得到的上清50 μl后再加入50 ul 4% PBSTM，轻轻晃动ELISA板，混匀后，37℃保温1 h；PBST 洗板3 次后，每孔加入用封闭液按1：5000比例稀释的HRP/ANTI-M13 100μl，37℃保温1 h；PBST 洗板6次，每孔加入100μl新鲜配制的 TMB 底物溶液，37℃保温15 min；加2mol/L H₂SO₄，每孔50μl中止反应，用酶标仪分别测定AFB1-BSA板及BSA板的OD450 值，P/N≥2.1的孔判为阳性克隆孔。

用包被液配制AFB1-BSA至终浓度2μg/ml，包被96孔ELISA 板，每孔100μl，4℃包被过夜；次日，倾掉包被液后，PBST 洗板3 次，然后用4％ PBSTM 封闭1 h；取AFB₁标准品储存液，用封闭液梯度稀释至十个不同的工作浓度，按黄曲霉毒素B1浓度由小到大的次序依次加入到ELISA 板中间的十列中（50μl /孔），再每孔加入50μl适当稀释倍数的噬菌体，每个毒素浓度重复3次；ELISA板最后一列只加PBST作为空白对照，第一列加入50μl PBST以及50μl上述间接ELISA方法筛选到的阳性克隆上清，作为B₀，轻摇板子混匀后，置37℃温箱反应1 h；PBST 洗板3 次后，每孔加入100 ul用封闭液按1：5000比例稀释的HRP/ANTI-M13，37℃保温1 h；PBST 洗板6次，每孔加入100μl新鲜配制的 TMB 底物溶液，37℃保温15 min；加2 mol/L H₂SO₄，每孔50 μl中止反应，用酶标仪分别测定OD₄₅₀ 值；根据黄曲霉毒素B1浓度对B/B₀值绘制竞争曲线，计算IC₅₀。由此筛选得到吸光值和灵敏度均较高的孔（第一块ELISA板上面的A7孔），挑取master plate中对应的菌液加以扩大培养即为黄曲霉毒素重组单链抗体1A7。 

具体地，所述的黄曲霉毒素重组单链抗体1A7可按以下方法获得： 

1)获得能分泌黄曲霉毒素重组单链抗体1A7的菌液，在SOBAG平板上面划线培养分离出单菌落，随机挑取一个单菌落加入3 ml 2YT-AG液体培养基中，225 rpm，30℃培养过夜；

2) 取1 ml 过夜培养好的1A7小样接种于100 ml 2×YT-AG液体培养基中，37℃恒温摇床中培养至OD600＝0.5-0.8；

3）按大肠杆菌：辅助噬菌体个数比为1：5的比例将辅助噬菌体M13KO7加入到步骤（2）所摇的菌液中，37 ℃恒温摇床培养1 h；

4）4℃，5 000 rpm，冷冻离心10 min，无菌操作台中小心去除上清，菌体沉淀用100 ml 2YT-AK液体培养基重悬，37℃，225 rpm培养过夜；

5) 过夜培养物以12000 rpm，4℃冷冻离心20 min，无菌操作台中将上清小心移至新的离心管中，加入1/5 体积的PEG/NaCl 水溶液，冰浴1 h，沉淀上清中的噬菌体；

6）4℃，12000 rpm，冷冻离心20 min，倒掉上清，将沉淀于离心管底部的噬菌体用10ml PBS重悬，4℃保存备用。

（3）黄曲霉毒素重组单链抗体1A7的特性及测序分析结果如下： 

采用间接竞争ELISA方法测定黄曲霉毒素重组单链抗体1A7的抗体特异性，具体用用交叉反应率描述，测试方法如下：将AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂和AFM₁五种不同标准品储存液，用封闭液梯度稀释至十个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制五种黄曲霉毒素的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50%时的标准品浓度，用IC₅₀表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率：交叉反应率（%）=（AFB₁ IC₅₀/ 类似物IC₅₀）×100%。得到黄曲霉毒素单链抗体1A7对于黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC₅₀ 为20 pg/mL，其对于五种主要黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为100%、166%、100%、0.1%和11.1%，可见该黄曲霉毒素重组单链抗体1A7是一种黄曲霉毒素通用重组抗体。

黄曲霉毒素重组单链抗体1A7的特征性序列测定：将黄曲霉毒素重组单链抗体1A7的克隆菌液送至上海Invitrogen公司进行测序分析，测序引物为噬菌体载体通用引物R1：5’-CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3’，测序结果采用GENETOOL软件及上传网站IGMT/V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/)进行抗体可变区序列分析。得到其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，其中重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，编码基因序列为SEQ ID NO:4所示，其中重链可变区编码基因序列为SEQ ID NO:5所示，轻链可变区编码基因序列为SEQ ID NO:6所示。 

与传统的单克隆抗体或多克隆抗体相比，重组单链抗体可以在很短的时间内大量生产。重组单链抗体每500ml细菌培养液在2天时间内约能获得5mg-50mg单链抗体；而传统杂交 

瘤单克隆抗体每只小鼠需要2-8周的时间才能得到约5mg-10mg单克隆抗体。

黄曲霉毒素重组单链抗体1A7能有效识别黄曲霉素B1、B2、G1等，可应用于黄曲霉毒素B1、B2、G1等的免疫学检测领域，包括用于食品安全领域相关的农产品、食品等中黄曲霉毒素总量的ELISA检测、液相色谱法检测黄曲霉毒素毒素中的样品前处理等，对食品安全领域黄曲霉毒素监控有重要意义。 

序列表

 

<110>  中国农业科学院油料作物研究所

 

<120>  黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗

       体1A7

 

<160>  6    

 

<210>  1

<211>  261

<212>  PRT

<213> 小鼠

 

<400>  1

Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

1                         5                             10                            15

Pro Gly Gly Pro Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr

                          20                            25                           30

Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Leu Arg Gln Thr Ala Glu Lys

                          35                            40                           45

Arg Lle Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr

                           50                         55                           60

Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

                            65                          70                           75

Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu

                             80                            85                          90

Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Ser His Asp Tyr Ala Trp Ser

                             95                          100                        105

Phe Gly Val Trp Gly Ala Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser Ser

                         110                          115                        120

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

                          125                          130                        135

Ser Ala Leu Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly

                         140                          145                        150

Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr

                          155                         160                         165

Thr Ser Asn Ser Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Ala Asp His Leu

                        170                          175                         180

Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Ile Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val

                          185                         190                         195

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu

                          200                         205                          210

Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys

                           215                          220                         225

Ala Leu Trp Asp Ser Asn His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

                         230                           235                           240

Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro

                          245                            250                        255

Asp Pro Leu Glu Pro Arg 

                          260

 

<210>  2

<211>  121

<212>  PRT

<213> 小鼠

 

<400>  2

Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

1                         5                             10                            15

Pro Gly Gly Pro Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr

                          20                            25                           30

Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Leu Arg Gln Thr Ala Glu Lys

                          35                            40                           45

Arg Lle Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr

                           50                         55                           60

Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

                            65                          70                           75

Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu

                             80                            85                          90

Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Ser His Asp Tyr Ala Trp Ser

                             95                          100                        105

Phe Gly Val Trp Gly Ala Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser Ser

                         110                          115                        120

Ser

 

<210>  3

<211>  125

<212>  PRT

<213> 小鼠

 

<400>  3

Ala Leu Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1                          5                            10                            15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr Thr

                           20                            25                         30

Ser Asn Ser Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Ala Asp His Leu Phe

                            35                            40                           45

Thr Gly Leu Ile Gly Gly Ile Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro

                           50                             55                          60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr

                              65                           70                          75

Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Ala

                          80                             85                           90

Leu Trp Asp Ser Asn His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

                            95                             100                         105

Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp

                         110                           115                         120

Pro Leu Glu Pro Arg 

                        125

 

<210>  4

<211>  783

<212>  DNA

<213>  小鼠

 

<400>  4

atggcccagg tcaaactgca gcagtcaggg ggaggcttag tgaagcctgg agggcccctg 60

aaactctcct gttcagcctc tggattcact ttcagtaact atggcatgtc ttggcttcgc 120

cagaccgcgg agaagaggct ggagtgggtc gcaagtatta gtggtggtag ttatagctac 180

tatccagaca gtgtgaaggg gcgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaacctg 240

tacctacaaa tgagtagtct gaagtctgag gacacggcct tgtatttctg tgcaagtcat 300

gattacgcct ggtccttcgg tgtctggggc gcaggggcca cggtcaccgt ctcctcatcc 360

tcaggtggcg gtggctccgg cggtggtggc agcggtggcg gcggttctgc tcttgtgact 420

caggaatctg cactcaccac atcacctggt gaaacagtca cactcacttg tcgctcaagt 480

agtggggctg ttacaactag taactctgcc aactggatcc aagaaaaagc agatcattta 540

ttcactggtc taataggtgg cattaacaag cgagctccag gtgttcctgc cagattctca 600

ggctccctga ttggagacaa ggctgccctc accatcacag gggcacagac tgaggatgag 660

gcagtatatt tctgtgctct atgggacagc aaccatttgg tgttcggtgg aggaaccaaa 720

ctgactgtcc taggtgcggc cgcaggtgcg ccggtgccgt atccggatcc gctggaaccg 780

cgt                                                                                        783

 

<210>  5

<211>  363

<212>  DNA

<213>  小鼠

 

<400>  5

atggcccagg tcaaactgca gcagtcaggg ggaggcttag tgaagcctgg agggcccctg 60

aaactctcct gttcagcctc tggattcact ttcagtaact atggcatgtc ttggcttcgc 120

cagaccgcgg agaagaggct ggagtgggtc gcaagtatta gtggtggtag ttatagctac 180

tatccagaca gtgtgaaggg gcgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaacctg 240

tacctacaaa tgagtagtct gaagtctgag gacacggcct tgtatttctg tgcaagtcat 300

gattacgcct ggtccttcgg tgtctggggc gcaggggcca cggtcaccgt ctcctcatcc 360

tca                                                                                363

 

<210>  6

<211>  375

<212>  DNA

<213>  小鼠

 

<400>  6

 

gctcttgtga ctcaggaatc tgcactcacc acatcacctg gtgaaacagt cacactcact 60

tgtcgctcaa gtagtggggc tgttacaact agtaactctg ccaactggat ccaagaaaaa 120

gcagatcatt tattcactgg tctaataggt ggcattaaca agcgagctcc aggtgttcct 180

gccagattct caggctccct gattggagac aaggctgccc tcaccatcac aggggcacag 240

actgaggatg aggcagtata tttctgtgct ctatgggaca gcaaccattt ggtgttcggt 300

ggaggaacca aactgactgt cctaggtgcg gccgcaggtg cgccggtgcc gtatccggat 360

ccgctggaac cgcgt                                                                     375