植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达及工程菌培养基初步优化

摘要

植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶,将其添加到单胃动物植物性饲料中,可以释放植酸中的无机磷以及被植酸络合的Ca<'2+>、Mg<'2+>、Zn<'2+>等矿物元素和一些蛋白质,从而解除植酸抗营养作用、提高动物饲料的营养价值,同时也减少了动物粪便中植酸磷的含量,降低了磷对环境的污染程度.研究表明,饲料中添加植酸酶可使其中磷利用率提高60％,粪便中磷排出量减少40％,还可以提高饲料转化率,改善动物的生产性能,因此对提高养殖业的经济效益及环境保护均具十分重要意义.植酸酶主要存在于微生物和植物中,动物体内也有少量存在,但真正具有开发价值的主要是微生物产生的植酸酶,尤其是曲霉产生的酸性植酸酶.国外早在1991年就成功地利用DNA重组技术获得第一株酸性植酸酶的工程菌,并已投入商品化生产.目前已开始从事植酸酶的植物和动物基因工程的研究,已成功将植酸酶基因导入苜蓿、烟草、小鼠和猪的唾液腺中.国内对植酸酶的研究起步较晚,到目前为止,植酸酶野生菌株产酶水平低下的问题仍然没有得到彻底解决,目前市场上应用的植酸酶制剂多属进口产品,且价格昂贵.因此,提高植酸酶野生菌株产酶水平,降低其生产成本,对实现植酸酶产品国产化并获取自己专利具有十分重要意义.而提高野生菌株产酶水平的主要思路集中在通过基因工程手段克隆植酸酶基因或进行适当改造,然后将这些优良基因导入适当的宿主菌,进一步筛选出高产工程菌株,优化发酵工艺条件从而实现植酸酶基因的高效表达.因此,该实验着力于将已构建的可进行诱导调控分泌表达的毕赤酵母整合型表达载体转化毕赤酵母受体菌,进而筛选出高产稳产植酸酶的工程菌,为植酸酶的规模化生产提供优良菌种,并对工程菌株的产酶培养基进行初步优化从而为规模化生产提供科学依据.

目录

文摘

英文文摘

第一章、文献综述

1.1植酸酶分子生物学研究进展

1.2毕赤酵母表达系统研究进展

第二章、引言

2.1研究意义

2.2技术路线

第三章、材料与方法

3.1菌种和质粒载体

3.2主要试剂

3.3主要仪器设备

3.4主要溶液及其配制

3.5引物来源

3.6转化DNA样品的制备

3.7毕赤酵母感受态细胞的制备

3.8毕赤酵母的电穿孔转化

3.9阳性转化子的筛选及鉴定

3.10表达产物的部分酶学性质的初步研究

3.11重组植酸酶粗酶比活力的测定

3.12重组酵母植酸酶表达量与诱导培养时间的关系

3.13重组酵母的遗传稳定性研究

3.14重组酵母的甲醇营养表型研究

3.15均匀设计法优化工程菌培养基

第四章、结果与分析

4.1毕赤酵母的电穿孔转化与筛选

4.2酵母菌落PCR的电泳结果

4.3标准磷曲线的绘制

4.4重组酶最适作用pH值

4.5重组酶最适作用温度

4.6重组酶热稳定性研究

4.7重组酵母植酸酶表达量与诱导培养时间的关系

4.8重组酶SDS-PAGE分析

4.9重组植酸酶粗酶比活力的测定

4.10重组酵母的遗传稳定性

4.11重组酵母的甲醇营养表型

4.12工程菌培养基的初步优化

第五章、讨论

5.1毕赤酵母细胞的电穿孔转化

5.2表达载体选择

5.3表达载体的线性化及整合方式

5.4重组酶与天然植酸酶部分酶学性质有所改变的可能原因

5.5工程菌株培养特性的探讨

5.6工程菌发酵工艺条件的优化

第六章、小结

参考文献

主要缩略词表

致谢