埃他卡林对肺动脉高压及其心脏重构的影响以及药理学机制的研究

摘要

目的:动脉型肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是一组伴随肺血管阻力持续升高的迟发性和渐进性疾病,最终导致右心室衰竭而死亡。目前,确切的发病机制还不明确,炎症因子、肺血管内皮细胞损伤、肺动脉平滑肌细胞增殖参与肺动脉高压发生、发展的整个过程。
　　埃他卡林是一个新型ATP敏感钾通道开放剂,优先激活SUR2B/Kir6.1亚型而对SUR1/Kir6.2亚型无作用,本实验室先前的实验表明:埃他卡林通过刺激舒血管物质一氧化氮的释放,抑制缩血管物质内皮素的分泌,恢复内皮细胞的正常功能,埃他卡林可抑制低密度脂蛋白、同型半胱氨酸和高糖诱导的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1( ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1) mRNA表达上调,防治压力超负荷大鼠心肌肥大和心力衰竭,逆转低氧诱导的大鼠肺动脉血管重构。离体实验证实,埃他卡林对内皮素-1诱导的人和兔的肺血管平滑肌细胞增殖有治疗作用。
　　慢性低氧和野百合碱注射均可建立肺动脉高压模型,但两者的损伤程度和形成机制不同,低氧诱导的肺动脉高压通常只有中度有限的血管内膜增厚,伴随血管外膜不同程度的改变;野百合碱诱导的肺动脉高压严重,肺血管内皮细胞变性、肥大,血管平滑肌过度增生,伴肺组织水肿,被认为是动脉型肺动脉高压的标准模型。
　　本研究通过野百合碱诱导的大鼠动脉型肺动脉高压模型,观察埃他卡林对动脉型肺动脉高压的防治作用。
　　方法:
　　1实验分组与给药方式
　　50只成年Wister大鼠随机分为空白对照组,野百合碱模型组,野百合碱模型+埃他卡林1、3、9mg/kg/d治疗组,每组10只大鼠,模型组和埃他卡林治疗组一次性腹腔注射野百合碱50mg/kg,空白对照组腹腔注射同体积的生理盐水,埃他卡林治疗组于建模后当日开始灌胃给药1、3、9 mg/kg/d(埃他卡林溶于生理盐水),对照组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,时间持续28天。
　　2检测指标
　　第28天,实验动物称重,充分麻醉后,两根聚乙烯导管分别插入右心室和左颈总动脉,通过多道生理记录仪测量右心室压力、体循环压力、心率;留存血液标本测量血清中一氧化氮及血浆中内皮素、脑钠肽含量;处死实验动物摘除肺组织和心脏,分离右心室和左心室,计算右心肥大指数;右心室和左肺组织浸泡于10％福尔马林制作病理标本,右肺剪碎、称重,与生理盐水充分研磨,制备20%匀浆液用于检测肿瘤坏死因子、一氧化氮、内皮素含量;右室心肌和肺组织的病理变化采用苏木素-曙红(HE)染色;计算肺小动脉管壁厚度占管壁外径的百分比,反映肺小动脉的肌化程度;原位末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)法用于评价右心室心肌组织细胞凋亡,用凋亡指数来表示心肌组织细胞发生凋亡的情况;免疫组化应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法检测右室心肌组织脑钠肽的蛋白表达,平均光密度值反映脑钠肽的蛋白表达的程度。
　　3统计方法
　　用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析,实验数据表达应用mean±SD,各组间均数比较行 one-way ANOVA进行统计学分析,各组间比较选用 Student Newman–Keuls post hoc test,以P<0.05作为显著性差异标准。
　　结果:
　　1埃他卡林对血流动力学影响
　　野百合碱腹腔注射建模后第28天,与空白对照组比较,模型组大鼠右心室压力升高,心率和平均动脉压下降,埃他卡林1、3、9mg/kg/d给药后,降低右心室压力,升高心率和平均动脉压,与模型组比较差异显著。
　　2埃他卡林对野百合碱诱导的右心室重构具有防治作用
　　建模后第28天,与空白对照组比较,模型组大鼠右室肥厚指数升高,体重增速缓慢,埃他卡林1、3、9mg/kg/d给药后,右心肥厚指数下降,但是大鼠体重增速缓慢没有改变。
　　3埃他卡林下调右室心肌组织细胞脑钠肽蛋白的表达
　　脑钠肽是心力衰竭的生物标志物。建模后第28天,与空白对照组比较,模型组大鼠脑钠肽蛋白表达升高,埃他卡林9mg/kg/d组显著降低脑钠肽蛋白的表达。
　　4埃他卡林改善右室心肌和肺组织的病理变化
　　建模后第28天,模型组组织学检查:光镜下观察肺组织,肺泡单核细胞浸润,实变区内成纤维细胞增生;内膜平滑肌细胞紊乱,增生,肺小动脉壁增厚,狭窄,闭塞,肺组织中的毛细血管略有扩大和拥挤;支气管分泌物增加,支气管腔内发现坏死的上皮细胞,红细胞和水肿液。心脏的右心室心肌间质纤维结缔组织增生,单核细胞和淋巴细胞增多,散在、多发的小片状心肌组织坏死灶。埃他卡林9mg/kg/d可以改善野百合碱引起肺组织和右心室组织的病理变化。与空白对照组比较,模型组肺小动脉管壁厚度显著增厚,埃他卡林9mg/kg/d组显著降低肺小动脉重构,肺小动脉管壁厚度与管壁外径的百分比值下降。
　　5埃他卡林减轻右室心肌组织细胞凋亡
　　建模后第28天,与空白对照组比较,模型组右室心肌组织细胞凋亡率显著上升,埃他卡林9mg/kg/d组右室心肌组织细胞凋亡率下降,同模型组比较,有统计学意义。
　　6埃他卡林下调血清一氧化氮、血浆内皮素-1和脑钠肽含量
　　建模后第28天,与空白对照组比较,模型组血清中一氧化氮、血浆内皮素-1和脑钠肽含量显著上升,埃他卡林1、3、9mg/kg/d组血清中一氧化氮、血浆内皮素-1和脑钠肽含量下降,同模型组比较,有统计学意义。
　　7埃他卡林下调肺组织中肿瘤坏死因子、一氧化氮和内皮素含量
　　建模后第28天,与空白对照组比较,模型组肺组织中肿瘤坏死因子、一氧化氮和内皮素-1含量显著上升,埃他卡林1、3、9mg/kg/d治疗组肺组织中肿瘤坏死因子、一氧化氮和内皮素-1含量下降,同模型组比较,差异显著。
　　结论:在野百合碱诱导的肺动脉压模型中,新型钾通道开放剂埃他卡林可以显著降低右心室压力升高和右心室重构,增加心率和平均动脉压,抑制一氧化氮、内皮素-1、脑钠肽和肿瘤坏死因子病理性释放,改善右心室和肺组织的病理改变,表明埃他卡林对动脉型肺动脉高压及右心衰竭具有防治作用。

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缩 略 词 表

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前言

实 验 材 料

1 实验动物

2 主要试剂

3 仪器

实 验 方 法

1大鼠肺动脉高压模型建立

2 实验大鼠分组与给药方式

3 实验大鼠血流动力学测定

4 实验大鼠心脏重量、心脏指数、右室指数的测定

5 组织标本制备

6 病理学观察

7血清中NO含量的测定

8 血浆ET-1、BNP含量测定

9肺组织中NO、TNF-α、ET-1含量的测定

10 TUNEL法检测右室心肌组织细胞凋亡

11免疫组织化学检测右室心肌组织BNP蛋白的表达

12统计学分析

实 验 结 果

1. 野百合碱所致大鼠肺动脉高压的病理生理学特征

2埃他卡林对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压的防治作用

3埃他卡林对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠右室心肌和肺组织病理变化的影响

4 埃他卡林对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠的药理学机制

讨论

结 论

参考文献

文献综述

参考文献：

个 人 简 历

致谢