Debaryomyces sp.甘油激酶的分离纯化及基本性质研究

摘要

从已有的19株菌种中筛选获得产甘油激酶(GK，E.C 2.7.1.30)酵母菌，对该菌种进行诱导及发酵条件的优化，通过甘油诱导培养后其菌体产量提高了50[％]，产酶活力提高20[％]。确定其最适培养基为([％])：葡萄糖O.1，KCl0.18，酵母膏0.3，柠檬酸0.6，甘油0.5，初始pH为5.0。最适培养条件为：接种量6[％]，31℃培养25h，通气量为250ml三角瓶装120ml培养基，摇床转速160r/min。在最适培养基及最适培养条件下，甘油激酶活力可达到1.19 U/mg，菌体产量达到18g/L。 从产甘油激酶的德巴利酵母中分离纯化甘油激酶。德巴利酵母经过甘油诱导发酵培养后，收集到的菌体采用高压均质机进行破碎处理，通过35％～75％硫酸铵盐析粗分离后，依次经过Q-Sepharose FF离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析、Cibacron Blue F3G-A亲和层析分离得到理想纯度的甘油激酶样品，其比活达到67.79U/mg，纯化倍数为199倍，总回收率为26.3％。对分离得到的甘油激酶采用PAGE、SDS-PAGE进行鉴定为单一染色条带，等电聚焦测定其等电点为4.8。凝胶过滤法测定甘油激酶天然分子量为230,000Da，而SDS-PAGE电泳显示单一条带，分子量为57,500Da，故断定该酶由四个分子量相同的亚基所组成。通过对部分酶学性质的研究，结果表明：该酶的最适反应温度为40℃，在温度低于45℃处理15min稳定性较好；最适pH为7.O，在pH5.0～8.0处理24h稳定性较好。在最适条件下测定甘油和ATP为底物时的米氏常数分别为3.5×10<'-5>mol/L，4.46×10<'-4>mol/L。金属离子及化合物对酶活性影响实验表明，Fe<'2+>、Mn<'2+>、Ag<'+>、Hg<'2>+、Cu<'2+>、Sn<'2+>、Zn<'2+>、Ni<'2+>、Cd<'2+>及硫柳汞对酶活性有较大抑制作用，EDTA和α-巯基乙醇有部分激活作用，故可作酶的稳定剂。

目录

第一部分实验部分产甘油激酶菌种的筛选、培养条件的优化和酶的分离纯化及其基本性质的研究引言

第一部分实验部分产甘油激酶菌种的筛选、培养条件的优化和酶的分离纯化及其基本性质的研究一、产甘油激酶酵母菌株的筛选、培养条件的优化

第一部分实验部分产甘油激酶菌种的筛选、培养条件的优化和酶的分离纯化及其基本性质的研究二、产甘油激酶菌株的鉴定

第一部分实验部分产甘油激酶菌种的筛选、培养条件的优化和酶的分离纯化及其基本性质的研究三、甘油激酶的分离纯化和基本特性鉴定

第一部分实验部分产甘油激酶菌种的筛选、培养条件的优化和酶的分离纯化及其基本性质的研究论文总体总结

第二部分综述甘油激酶及其在甘油代谢中的研究进展

第三部分结束语