杏仁过敏原ELISA方法的建立及加工方式对致敏性的影响

摘要

杏仁属树类坚果，其过敏原蛋白amandin是重要的食品过敏原之一，能引起IgE介导的Ⅰ型过敏反应。
　　本论文提取了国产苦杏仁、甜杏仁的过敏原蛋白amandin，免疫动物制备了兔抗、鼠抗多克隆抗体，分别针对苦杏仁和甜杏仁中amandin建立了双抗体夹心酶联免疫检测方法，检测限分别为10.16±1.27ng/mL(苦杏仁amandin)和6.36±1.02ng/mL(甜杏仁amandin)。两种夹心ELISA检测方法与14种常见食物蛋白没有任何交叉反应，显示了方法良好的特异性。利用两种检测方法分别检测苦杏仁、甜杏仁和美国杏仁中的amandin，其中甜杏仁双抗体夹心ELISA法能分别检测低至12.11±1.70ng/mL的苦杏仁amandin和18.9±1.52ng/mL的美国杏仁amandin。将该方法用于法式小面包、饼干和脱脂牛奶中杏仁过敏原的检测，amandin的添加回收率为78.94％～125.15％，且通过板间、板内变异实验得出夹心ELISA法均具有良好的重现性。
　　论文进一步研究了干热(100℃，200℃，250℃，400℃)、湿热(60℃，100℃)、高温灭菌以及超高压(400MPa，500MPa，580MPa)处理对amandin性质的影响。以回收率评价amandin溶解性，SDS-PAGE、拉曼散射光谱分析蛋白结构，采用amandin间接竞争ELISA方法评价amandin的免疫反应性。结果显示，在干热处理时amandin呈现一定的稳定性，而湿热处理时，水分协同温度与高压作用明显破坏了amandin结构，降低了amandin的溶解性，其中湿热100℃和高温灭菌使amandin中多肽链22-24KDa发生降解，从而降低了其免疫反应性。超高压处理，使溶液中的amandin两个多肽链22-24KDa和38-41KDa均发生降解，极大地降低了其免疫反应性。结果显示高温杀菌和高压处理有可能成为一种用于食品加工中降低amandin致敏性的有效方法。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 食物过敏概述

1．2 食物过敏的原因及研究现状

1．2．1 食品过敏原

1．2．2 食物过敏反应机制

1．2．3 食品物过敏原的检测方法

1．2．4 降低食品过敏原致敏性的研究

1．2．5 食品过敏源致敏性变化的评价方法

1．3 杏仁过敏原

1．3．1 杏仁过敏原的研究进展

1．3．2 加工处理方法对杏仁过敏原致敏性的影响

1．4 论文研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要药品

2．1．3 主要试剂

2．1．4 实验仪器与材料

2．1．5 待测样品

2．1．6 实验溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 杏仁过敏原amandin的制备和鉴定

2．2．2 兔抗amandin多克隆抗体的制备

2．2．3 BALB／c小鼠抗amandin多克隆抗体的制备

2．2．4 杏仁过敏原的双抗体夹心ELISA方法的建立

2．2．5 检测方法特异性的测定

2．2．6 双抗体夹心ELISA法的精密度

2．2．7 双抗体夹心ELISA的适用性

2．2．8 杏仁过敏原间接竞争ELISA的建立

2．2．9 加工处理对过敏原致敏性和溶解性的影响

3 结果与讨论

3．1 杏仁过敏原蛋白的制备与鉴定

3．2 兔抗Amandin多克隆抗体的制备

3．2．1 抗血清效价的测定

3．2．2 抗血清的纯化

3．3 鼠抗Amandin多克隆抗体的制备

3．3．1 抗血清效价的测定

3．3．2 抗血清的纯化

3．4 双抗体夹心ELISA方法的建立

3．4．1 封闭液的优化

3．4．2 捕获抗体包被量的选择

3．4．3 检测抗体稀释倍数的选择

3．4．4 不同pH值和离子强度样品稀释液的优化

3．4．5 双抗体夹心ELISA法标准曲线的绘制

3．5 检测方法的特异性

3．6 双抗体夹心ELISA方法的精密度

3．6．1 板内变异

3．6．2 板间变异

3．7 双抗体夹心ELISA法的适用性

3．7．1 不同品种杏仁过敏原的检测

3．7．2 实际样品中Amandin的添加回收实验

3．8 杏仁过敏原间接竞争ELISA的建立

3．8．1 杏仁Amandin间接竞争ELISA的优化

3．8．2 杏仁间接竞争ELISA标准曲线绘制

3．9 加工处理对杏仁过敏原Amandin性质的影响

3．9．1 加工处理对Amandin溶解性的影响

3．9．2 加工处理对Amandin免疫反应性的影响

3．9．3 加工处理对Amandin结构的影响

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表的论文情况

致谢