食品酶制剂复配研究用酶的制备

摘要

食品酶制剂占世界酶制剂市场份额约30％，是酶制剂中最大的应用行业，在食品加工业中起着十分重要的作用。随着科学的进步和时代的发展，酶制剂工业正不断推出新型酶制剂、复合酶制剂。食品复配酶制剂以其高效、节能、针对性强、作用效果明显等优点备受使用者推崇，但目前国内复配酶制剂市场上生产的品种有限，还远远不能满足食品工业的需要，新型、高活力的复合酶制剂仍有待开发。酶制剂的复配研究需要高纯度的单酶做基础实验，根据单酶对底物分子的酶解特性进行复配组合的快速筛选。本课题主要利用蛋白质的分离纯化技术和蛋白质的含量与纯度检测技术，从两种自制复合酶的发酵液和一种商品酶制剂中制备出了四种高纯度的单酶，可作为食品酶制剂复配研究用酶，为酶制剂的复配研究奠定了基础。
　　从枯草芽孢杆菌发酵液中分离了氨肽酶。采用硫酸铵沉淀、Phenyl Sepharose疏水作用层析、Q Sepharose离子交换层析和Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析等方法完成了氨肽酶的高纯度单酶制备。经过上述四步纯化步骤，回收率为15.28％，氨肽酶的比活力达到9066.67 U/mg，纯化倍数为78.26。
　　从虎皮香菇发酵液中分离了漆酶。采用硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose离子交换层析和Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析等方法完成了漆酶的单酶制备。经过上述步骤，回收率为48.9％，漆酶的比活力达到7827.33 U/mg，纯化倍数为40.41，达到了SDS-PAGE电泳纯。
　　从果胶酶商品酶制剂中分离了聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶酯酶(PE)两种单酶。采用透析、硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose离子交换层析、Q Sepharose离子交换层析和Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析等方法，使PG较好的分离出来并得以纯化，纯化后的回收率为48.23％，比活力达到72.93 U/mg，纯化倍数为15.19，达到了SDS-PAGE电泳纯;采用透析、硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose离子交换层析和SephacrylS-200 HR凝胶过滤层析等方法，将PE从果胶酶商品制剂中较好的分离出来并得以纯化，经纯化后，回收率为8.9％，比活力为33.75 U/mg，纯化倍数为7.18，获得了高纯度的PE单酶。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 概述

1．2 氨肽酶概述

1．2．1 氨肽酶的来源

1．2．2 氨肽酶的应用

1．2．3 国外氨肽酶的研究进展

1．2．4 国内氨肽酶的研究进展

1．2．5 氨肽酶的研究方向

1．3 漆酶概述

1．3．1 漆酶的来源

1．3．2 漆酶的性质

1．3．3 漆酶的研究进展

1．3．4 漆酶的应用

1．3．5 漆酶的研究方向

1．4 果胶酶概述

1．4．1 聚半乳糖醛酸酶概述

1．4．2 果胶酯酶概述

1．4．3 果胶酶的复配研究

1．5 食品复配酶制剂的研究

1．6 蛋白质的分离纯化技术概述

1．6．1 蛋白质的粗级分离方法

1．6．2 蛋白质的高效分离纯化方法

1．7 本课题的研究意义及研究内容

1．7．1 本课题的研究意义

1．7．2 本课题的研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 粗酶液来源

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂及溶液

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 硫酸铵沉淀饱和度的确定实验

2．2．2 透析

2．2．3 离子交换层析中缓冲液pH值的确定实验

2．2．4 蛋白质浓度测定

2．2．5 SDS-PAGE法

2．2．6 Native-PAGE法

2．2．7 氨肽酶的酶活测定方法及分离纯化

2．2．8 漆酶的酶活检测方法与分离纯化

2．2．9 果胶酶PG的酶活检测方法与分离纯化

2．2．10 果胶酶PE的酶活检测方法与分离纯化

3 结果与讨论

3．1 氨肽酶的纯化研究

3．1．1 氨肽酶的硫酸铵盐析

3．1．2 疏水相互作用层析

3．1．3 Q Sepharose FF离子交换层析缓冲液pH的选择

3．1．4 Q Sepharose FF离子交换层析

3．1．5 Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析

3．1．6 氨肽酶的电泳检测

3．1．7 氨肽酶的纯化结果

3．2 漆酶的纯化研究

3．2．1 硫酸铵沉淀

3．2．2 DEAE Sepharose FF离子交换层析缓冲液pH的选择

3．2．3 DEAE Sepharose FF离子交换层析

3．2．4 Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析

3．2．5 漆酶的电泳检测

3．2．6 漆酶的纯化结果

3．3 果胶酶PG的纯化研究

3．3．1 硫酸铵沉淀

3．3．2 DEAE Sepharose FF离子交换层析缓冲液pH的选择

3．3．3 DEAE Sepharose FF离子交换层析

3．3．4 Q Sepharose FF离子交换层析

3．3．5 Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析

3．3．6 果胶酶PG的电泳检测

3．3．7 果胶酶PG的纯化结果

3．4 果胶酶PE的纯化研究

3．4．1 硫酸铵沉淀

3．4．2 DEAE Sepharose FF离子交换层析缓冲液pH的选择

3．4．3 DEAE Sepharose FF离子交换层析

3．4．4 Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析

3．4．5 果胶酶PE的电泳检测

3．4．6 果胶酶PE的纯化结果

4 结论

5 展望

参考文献

致谢