海洋黑曲霉内切纤维素酶的制备与纤维素酶复配

摘要

纤维素酶在生物炼制的纤维素水解中居于核心地位，由三种酶组合而成，分别为纤维素内切酶（内切-β-葡聚糖酶）、纤维素外切酶（外切-β-葡聚糖酶）和纤维二糖酶（β-葡萄糖苷酶），研究它们中各个酶的酶学性质和组成关系对纤维素水解十分重要。本实验室从东海海底淤泥中筛选得到一株产纤维素酶黑曲霉菌株，该菌株能够表达酶活较高的纤维素酶，在我们以前的工作中对其中的纤维二糖酶进行过详细的研究，本文将在优化产纤维素酶菌种的固态发酵条件的基础上，重点研究纤维素内切酶的酶学性质，并研究该菌种所产纤维素酶与里氏木霉纤维素酶复配效果，分析三种酶的组成关系，最后以水解稻草粉为例，说明纤维素酶的复配可能会起到更好的纤维素酶解效果。主要研究内容如下:
　　首先，优化了海洋黑曲霉纤维素酶固态发酵培养基条件。重点考察了底物、麦麸含量、初始含水量、发酵时间对该海洋黑曲霉固态发酵产纤维素酶的影响。结果表明在以稻草粉作为底物，麦麸含量为40％，初始含水量为70％，发酵到第6天时，滤纸酶活和内切纤维素酶活达到最高值，分别为9.64±0.37 U· gds-1和205.24±6.94 U· gds-1，而纤维二糖酶在第7天达到最大值76.27±3.13U· gds-1。
　　其次，建立了一条从海洋黑曲霉纤维素酶粗酶液中分离纯化内切纤维素酶的技术路线。采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-toyopearl离子交换层析和Phenyl Sephadex6FF疏水作用层析两步层析对其进行分离纯化，得到了电泳纯的内切纤维素酶组分。比活力由37.72U·mg-1提高到557.27 U·mg-1，纯化倍数达到了14.77倍，可用于酶学性质的研究。研究了该内切纤维素酶的酶学性质，包括分子量、温度和pH的稳定性，盐浓度对酶活的影响，金属离子对酶活的影响。结果表明该内切纤维素酶的分子量约为34 kDa，该酶的最适温度为60℃，最适pH为4.5，具有较好的热稳定性和pH稳定性。金属离子对内切纤维素酶的酶活影响较大，Cu2+、Fe2+具有一定的激活作用，Mn2+、Ni2+、Zn2+具有强烈的抑制作用。当NaCl浓度为40 g·L-1时具有最佳酶活，在NaCl浓度为20～60 g·L-1的环境下，其酶活均高于不合NaCl条件下的酶活，在200 g·L-1NaCl高盐浓度下，该酶尚能保持初始酶活的89％，基本确定，该酶是典型的耐盐型酶。对该酶的酶促进反应动力学进行研究发现其在pH4.5、60℃条件下米氏常数Km为11.7mg·mL-1， Vmax为943.4U·mg-1。
　　第三，在分析海洋黑曲霉与里氏木霉产生的纤维素酶组成基础上，研究了海洋黑曲霉与里氏木霉纤维素酶复配协同作用效果及酶学性质。将里氏木霉纤维素酶与海洋黑曲霉纤维素酶按不同比例进行混合，考察两者的协同作用，结果表明当复配纤维素酶酶系组成为滤纸酶活∶纤维二糖酶活(FPase∶Cellobiase)=1∶2时，协同作用达到最大，此时实际测得的FPase提高了43.9％。对复配纤维素酶的酶学性质研究发现，复配纤维素酶的酶学性质基本介于海洋黑曲霉纤维素酶和里氏木霉纤维素酶酶学性质之间。其滤纸酶活、内切纤维素酶活、纤维二糖酶活最适pH均为5.0，最适温度分别为50℃、50℃、60℃。复配纤维素酶50℃下保温48小时，48小时后相对于里氏木霉纤维素酶尚能保持较高活力。耐盐性方面复配纤维素酶也优于里氏木霉纤维素酶，当NaCl浓度为20％时，其能保持初始酶活力的50％以上。
　　最后，考察了海洋黑曲霉固态发酵和里氏木霉液态发酵产生的纤维素酶以及二者的复配纤维素酶水解稀酸预处理过的稻草粉的效果。底物用量为20g·L-1，纤维素酶用量为20U·(g substrate)-1，50℃下反应48h，复配纤维素酶产生的还原糖浓度为8.4 g·L-1，里氏木霉和海洋黑曲霉纤维素酶产生的还原糖浓度分别为6.5 g·L-1和4.1 g·L-1，三者对应的葡萄糖浓度分别为7.6 g·L-1、5.7g·L-1和3.4g·L-1，水解效率分别为54.72％、41.04％和24.08％，复配纤维素酶相对于里氏木霉纤维素酶和海洋黑曲霉纤维素酶水解效率分别提高了33.3％和123.5％。以上结果表明表明纤维素酶的复配具有更好的纤维素酶解效果。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 木质纤维原料

1．3 纤维素酶

1．3．1 纤维素酶组成及作用机制

1．3．2 纤维素酶生产菌种

1．3．3 纤维素酶应用

1．4 海洋微生物产纤维素酶研究现状

1．5 纤维素酶分离纯化

1．6 纤维素酶复配工艺及研究现状

1．7 本文的研究思路

第二章 海洋黑曲霉纤维素酶发酵培养基条件优化

2．1 前言

2．2 材料与设备

2．2．1 微生物菌种

2．2．2 主要试剂

2．2．3 发酵培养基

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 接种与培养

2．3．2 实验设计

2．3．3 纤维素酶的萃取

2．3．4 还原糖测定及葡萄糖标准曲线

2．3．5 蛋白质含量的测定及BSA标准曲线

2．3．5 纤维素酶活力的测定与定义

2．4 结果与讨论

2．4．1 葡萄糖标准曲线和蛋白质标准曲线

2．4．2 海洋黑曲霉液态发酵产纤维素酶时间进程

2．4．3 底物对海洋黑曲霉固态发酵产纤维素酶和胞外蛋白分泌的影响

2．4．4 麦麸含量对黑曲霉固态发酵产纤维素酶的影响

2．4．5 初始含水量对黑曲霉固态发酵产纤维素酶的影响

2．4．6 黑曲霉固态发酵产纤维素酶时间进程

2．5 本章小结

第三章 海洋黑曲霉内切纤维素酶的分离纯化及酶学性质

3．1 前言

3．2 材料与设备

3．2．1 主要试剂

3．2．2 主要设备

3．3 实验方法

3．3．1 纤维素酶的萃取

3．3．2 内切纤维素酶活力的测定与定义

3．3．3 硫酸铵分级沉淀

3．3．4 超滤与透析

3．3．5 DEAE-toyopearl阴离子交换层析

3．3．6 Phenyl sephadex 6FF疏水作用层析

3．3．7 SDS-PAGE鉴定

3．3．8 内切纤维素酶酶学性质

3．4 结果与讨论

3．4．1 DEAE-toyopearl阴离子交换层析纯化内切纤维素酶

3．4．2 Phenyl sephadex 6FF疏水作用层析纯化内切纤维素酶

3．4．3 各步纯化的比活力和纯化倍数

3．4．4 SDS-PAGE鉴定

3．4．5 内切纤维素酶酶学性质

3．5 本章小结

第四章 纤维素酶复配及酶学性质

4．1 前言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 里氏木霉液态发酵产纤维素酶

4．3．2 纤维素酶复配及协同作用

4．3．3 纤维素酶酶学性质

4．3．4 纤维素酶活测定

4．4 结果与讨论

4．4．1 里氏木霉液态发酵产纤维素酶

4．4．2 里氏木霉和黑曲霉纤维素酶粗酶液复配及协同作用

4．4．3 纤维素酶酶学性质

4．5 本章小结

第五章 复配纤维素酶水解稻草粉

5．1 前言

5．2 材料与设备

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验设备

5．3 实验方法

5．3．1 离子色谱分析葡萄糖和纤维二糖及标准曲线绘制

5．3．2 稻草粉预处理及其组分测定

5．3．3 纤维素酶水解稻草粉

5．3．4 葡萄糖和纤维二糖分析鉴定

5．3．5 离子色谱样品前处理

5．3．6 纤维素酶活测定

5．4 结果与讨论

5．4．1 离子色谱葡萄糖和纤维二糖标准曲线

5．4．2 稀酸预处理对稻草粉中纤维素、半纤维素、木质素含量的影响

5．4．3 复配纤维素酶用量对稻草粉水解的影响

5．4．4 复配纤维素酶对稻草粉水解产还原糖的影响

5．4．5 复配纤维素酶酶解稻草粉水解液分析的结果

5．4．6 复配纤维素酶对稻草粉水解葡萄糖得率的影响

5．5 本章小结

第六章 结论与建议

6．1 结论

6．2 建议

参考文献

作者简介