海洋黑曲霉固态发酵耐盐纤维素酶的培养条件优化及粗酶制剂的制备

摘要

纤维素酶是降解纤维素的一组酶系总称，其主要由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶组成。纤维素降解后可产生经济、丰富的生产原料，且有望解决自然界中不断产生的固体废物问题。本文将从固态发酵技术的优化、纤维素酶提取工艺的比较、在固态与液态发酵条件下丹宁-PEG提取工艺的研究及适应性、浓缩液真空冷冻干燥形成粗酶制剂等几个方面来探讨纤维素酶的生产问题，主要研究内容及结果如下:
　　在单因素条件下，确定了以麸皮∶玉米秸秆(1∶1)作为混合碳源，氯化铵作为氮源、含水量70％作为培养基。利用Plackett-Burman设计筛选出影响滤纸酶活力的显著因素:含水量、起始pH值。将显著因子通过最陡爬坡试验逼近最大酶活力区域。最后用Box-Behnken响应面分析确定了浅盘固态发酵产酶的最优培养条件:玉米秸秆48.53％、麸皮48.53％、NH4C11.94％、KH2PO40.2％、Fe(OH)30.16％、料水比为1∶2.2、接种量2％、初始pH4.28、装液量30g，置于温度为28℃的培养箱中培养7天。将培养基样品溶解在10倍体积的自来水中，于20℃摇床浸提1h，得到实验优化后的滤纸酶活达到了14.826 U/g，比优化前提高了75.12％。
　　将固体发酵得到的粗酶液进行纤维素酶提取。探究丹宁-聚乙二醇(PEG)沉淀在固态发酵条件下的工艺。结果表明:丹宁浓度12 mg/mL、丹宁沉淀静置时间为70 min时，纤维素酶沉淀率最高。PEG提取效果优于PVP，在PEG浓度为30 mg/mL、静置时间10 min下，对沉淀进行复溶，其纤维素酶回收率为96.97％，浓缩倍数为10。比较了丹宁-PEG沉淀、硫酸铵沉淀、超滤的浓缩效果，发现硫酸铵沉淀、超滤和丹宁-PEG沉淀均可达到一定的浓缩程度，但存在差异:硫酸铵用量大、酶活损失比较大;超滤浓缩耗时长、且膜易污染、易形成浓差极化;丹宁-PEG方便、快捷、易操作，但是成本也将是不容忽视的问题。
　　详细研究了丹宁-PEG沉淀法浓缩液态纤维素酶的过程，发现该方法比较适用于浓缩液态发酵生产的稀酶液。丹宁-PEG浓缩液态纤维素酶粗酶液的条件为:在丹宁浓度18 mg/mL、沉淀静置时间70 min，PEG浓度36mg/mL、提取静置时间为10 min时，总酶活回收率为93.5％。
　　论文将浓缩后的纤维素粗酶液进行真空冷冻干燥制成酶制剂，采用不同的保护剂，包括麸皮、玉米秸秆、稻草粉、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、淀粉等，结果表明海藻糖作为保护剂的效果最好，真空冷冻干燥后纤维素酶相对滤纸酶活为78.80％。

目录

声明

致谢

摘要

1．1 纤维素酶概述

1．1．1 纤维素酶的分子结构

1．1．2 纤维素酶酶学性质

1．1．3 纤维素酶酶解机制

1．1．4 纤维素酶的来源

1．1．5 纤维素酶的应用

1．2 纤维素酶的研究进展

1．2．1 纤维素酶的国外研究进展

1．2．2 纤维素酶的国内研究进展

1．3 海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的研究

1．4 纤维素酶的发酵工艺

1．5 纤维素酶的分离提取方法

1．6 真空冷冻干燥条件下对纤维素酶稳定性的影响研究

1．6．1 酶的保护作用机理

1．6．2 常见酶保护剂

1．7 本文的研究思路和内容

第二章 海洋黑曲霉固态发酵纤维素酶的培养条件优化

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 发酵菌株

2．2．2 材料与试剂

2．2．3 主要培养基

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 接种与培养

2．3．2 纤维素粗酶液的提取

2．3．4 干物质率测定

2．3．5 还原糖的测定方法以及葡萄糖标准曲线的制作

2．3．6 纤维素酶滤纸酶活(FPA)的定义与测定

2．3．7 实验步骤与设计

2．4 结果与分析

2．4．1 单因素分析

2．4．2 Plackett-Burman试验结果

2．4．3 最陡爬坡试验结果

2．4．4 中心组合设计结果

2．5 本章小结

第三章 丹宁酸絮凝法浓缩固态发酵纤维素酶液的研究

3．1 引言

3．2 材料与试剂

3．2．1 发酵菌株

3．2．2 主要材料与试剂

3．3 实验方法

3．3．1 固态发酵培养

3．3．2 粗酶液的提取

3．3．3 酶活力测定方法

3．3．4 蛋白质含量的测定及BSA标准曲线

3．3．5 纤维素酶浸提条件单因素分析

3．3．7 丹宁-聚乙二醇、硫酸铵沉淀和超滤浓缩的比较与选择

3．4 实验结果

3．4．1 纤维素酶浸提条件单因素分析

3．4．2 丹宁-聚乙二醇提取纤维素酶的研究

3．4．3 丹宁-聚乙二醇、硫酸铵沉淀和超滤浓缩的比较与选择

3．5 本章小结

第四章 丹宁酸絮凝法浓缩液态发酵纤维素酶的研究及酶制剂的制备

4．1 引言

4．2 实验仪器与材料

4．2．1 发酵菌株

4．2．2 主要材料与试剂

4．3 实验方法

4．3．2 丹宁-聚乙二醇用于提取液态发酵中的纤维素酶

4．3．3 酶保护剂对真空冷冻干燥的影响

4．3．4 蛋白质回收率

4．3．5 酶活力测定方法

4．3．6 残余酶活率

4．4 实验结论

4．4．1 丹宁-聚乙二醇在液态纤维素酶的适应性

4．4．2 丹宁-PEG在液态纤维素酶的应用条件

4．4．3 酶保护剂对真空冷冻干燥的影响

4．5 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

作者简介

在学期间所取的科研成果