肌醇六磷酸对人结肠癌细胞系HT-29生物学行为的影响

摘要

目的：用肌醇六磷酸(Inosito.Hexaphosphate，IP6)作用于人结肠癌细胞系HT-29不同时间，观察IP6作用不同时间对HT-29细胞生物学行为的影响并对其作用机制进行探讨。 方法：将3.3mmol/L的IP6作用于HT-29细胞不同时间(3d、6m、12m)，以未经IP6作用的HT-29细胞作为对照，通过裸鼠体内接种致瘤的方法观察IP6对HT-29细胞致瘤性的影响；将3.3mmol/L的IP6作用于HT-29细胞不同时间(3d、6m、12m)，以未经IP6作用的HT-29细胞作为对照，应用双层软琼脂培养测定细胞克隆形成率的变化；分光光度法测定细胞内肠型碱性磷酸酶(IAP)和细胞培养液内乳酸脱氢酶(LDH)活性的改变；RT-PCR法检测细胞内bcl-2、c-My.mRNA的表达变化；免疫细胞化学法检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞色素c(Cyt-c)表达的改变。 结果：裸鼠体内移植瘤实验结果显示，IP6作用组HT-29细胞裸鼠体内移植瘤的成瘤时间较对照组长，成瘤率较对照组低，最终形成肿瘤的体积也明显小于对照组，而且这些作用都表现出明显的时间依赖性。双层软琼脂培养结果表明，经IP6作用的HT-29细胞的集落形成能力随作用时间的延长逐渐降低，而克隆形成抑制率随作用时间的延长逐渐升高。分光光度法结果显示：各实验组细胞内肠型ALP比活性与对照组相比均显著升高(P<0.01)，且各实验组之间表现出明显的时间依赖趋势（各实验组之间相比均为P<0.05）；细胞培养液中LDH活性测定结果显示各实验组细胞培养液中LDH活性均高于对照组且差别具有高度统计学意义(P<0.01)。随着IP6作用时间的延长，细胞培养液内的LDH活性逐渐升高(各实验组之间相比均为P<0.05)。RT-PCR实验结果显示，与对照组相比，各IP6作用组bcl-2和c-My.mRNA表达均显著降低，差别具有高度统计学意义(P<0.01)；而且bcl-2和c-My.mRNA表达均表现出随IP6作用时间延长而逐渐降低的趋势。免疫细胞化学实验结果表明：不同作用时间的IP6均可抑制HT-29细胞内的PCNA蛋白表达(P<0.05)，并且随着作用时间的延长，PCNA蛋白的表达随之降低（各IP6作用时间组之间相比均为P<0.05）；不同作用时间的IP6作用均可升高细胞内细胞色素.(Cyt-c)的水平（P<0.01），且随作用时间的延长，Cyt-c蛋白的表达有升高的趋势(各IP6作用时间组之间相比均为P<0.05)。 结论：1、IP6作用能够使HT-29细胞裸鼠体内致瘤能力的降低，表现为成瘤时间延长、成瘤体积减小及成瘤率降低，作用具有时间依赖趋势。2、IP6能够抑制HT-29细胞的增殖，使细胞克隆形成能力降低及细胞内PCNA水平的降低，且随作用时间的延长作用更加明显。3、IP6具有促进HT-29细胞分化的作用，这一作用表现在细胞集落形成能力的降低、细胞内分化相关基因c-Myc表达的减低以及分化标志酶--肠型碱性磷酸酶比活性的升高，作用表现出明显的时间依赖趋势。4、IP6可以促进HT-29细胞发生凋亡，这一作用可能与bcl-2、Cyt-c参与的线粒体凋亡通路密不可分，且与作用时间关系密切。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章实验材料与方法

1.1主要试剂

1.2人结肠癌细胞系HT-29

1.3实验仪器

1.4 IP6溶液的制备

1.5人结肠癌细胞系HT-29细胞培养方法

1.6裸鼠体内致瘤实验

1.7双层软琼脂培养测定细胞克隆形成率

1.8肠型碱性磷酸酶(IAP)比活性测定

1.9细胞培养液乳酸脱氢酶活性测定

1.10 RT-PCR法检测IP6作用不同时间对HT-29细胞内bcl-2、c-myc mRNA表达的影响

1.11免疫细胞化学法检测IP6作用不同时间对HT-29细胞内PCNA、Cyt-c蛋白表达的影响

1.12统计学方法

第二章结果

2.1裸鼠体内致瘤实验

2.2双层软琼脂培养测定细胞克隆形成率

2.3肠型碱性磷酸酶比活性测定

2.4 HT-29细胞培养液中乳酸脱氢酶活性测定

2.5 RT-PCR法检测IP6作用不同时间对HT-29细胞内bcl-2 mRNA表达的影响

2.6 RT-PCR法检测IP6作用不同时间对HT-29细胞内c-Myc mRNA表达的影响

2.7免疫细胞化学法检测IP6作用不同时间对HT-29细胞内PCNA、Cyt-c蛋白表达的影响

第三章讨论

结论

参考文献

综述 肌醇六磷酸在癌症预防和治疗中的作用

攻读学位期间的研究成果

致谢