重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体A7基因真核表达载体的构建

摘要

重症肌无力(myastheniagravis，MG)是抗乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor,AchR)抗体介导的器官特异性自身免疫病。AchR是由α2βγδ五个同源亚单位组成的跨膜糖蛋白，MG患者血清中多数抗AchR抗体针对的是α亚单位上的主要免疫原区(mainimmunogenicregion，MIR)。当致病性抗体与神经肌肉接头处突触后膜上相邻两个AchRα亚单位上的MIR相结合后，通过抗原调变或激活补体作用使突触后膜损伤，AchR数量减少，结果出现肌肉收缩无力。由抗AchR抗体制备的单链抗体(singlechainvariablefragment，ScFv)作为单价片段，只能与一个α亚单位上的MIR结合，因此不引起抗原调变作用，且ScFv无Fc段，不能激活补体导致AchR损伤；但是，ScFv与MIR结合后，可以特异性地封闭抗AchR抗体的结合位点，从而对AchR起到保护作用。 本实验应用聚合酶链反应(PCR)方法从重组质粒pHEN2-ScFvA7上扩增出鼠源性ScFvA7基因，应用纯化试剂盒进行纯化。纯化后的PCR产物经EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化，再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC9K连接。将连接产物转化E.coliDH5α并扩增，再用AvrⅡ和EcoRⅠ酶切检查ScFvA7基因插入的正确性。构建pPIC9K-ScFvA7重组载体经测序发现核苷酸序列正确，并且ScFvA7基因正确克隆至载体开放读码框架内。结果表明已成功的构建了pPIC9K-ScFvA7重组表达载体，为下一步进行真核表达及之后对MG的基因治疗奠定了基础。

目录

摘要

第一章 前 言

第二章 实验材料

第三章 实验方法

第四章 结 果

第五章 讨 论

结 论

参考文献

致 谢

综述单链抗体在巴期德毕赤酵母中表达研究进展