过表达乳糖代谢途径关键酶对产2,3-丁二醇菌株利用乳糖效率的影响

摘要

2，3-丁二醇作为一种重要的生物化学品，广泛应用于化工、燃料、食品、航空航天等领域。乳清是乳制品行业的主要副产物，含有丰富的营养物质，在生产化工产品方面主要用于生产燃料乙醇。与生产燃料乙醇相比，2,3-丁二醇具有更高的产品附加值。阴沟肠杆菌CICC10011是目前用于生产2，3-丁二醇研究最多的菌株，其2，3-丁二醇的得率及最终产物浓度均很高，但利用乳糖发酵较慢;而肺炎克雷伯氏菌KG1虽然在2，3-丁二醇生成能力方面略次于10011，但其利用乳糖速度较快。本实验以KG1和10011为出发菌株，通过过表达乳糖代谢途径关键酶（乳糖通透酶和β-半乳糖苷酶），以期望提高菌株对乳糖的利用效率。主要内容和结果如下:
　　(1)在KG1和10011菌株乳糖发酵培养基中添加β-半乳糖苷酶，比较不同添加量的β-半乳糖苷酶对菌株利用乳糖速度的影响。结果表明外源添加β-半乳糖苷酶可以加快KG1和10011利用乳糖的速度。
　　(2)以KG1基因组为模板扩增β-半乳糖苷酶基因bgaB和乳糖通透酶基因lacY(记做KlacY)，以E.coli MG1655基因组为模板扩增乳糖通透酶基因lacY(记做ElacY)，将三个基因片段单独连接到表达载体pUC18K上，构建得到重组质粒，并分别转入KG1和10011中，得到重组菌株KG1/pUC18K-bgaB，KG1/pUC18K-ElacY，KG1/pUC18K-KlacY和10011/pUC18K-bgaB,10011/pUC18K-ElacY,10011/pUC18K-KlacY。
　　(3)对KG1/pUC18K-bgaB，10011/pUC18K-bgaB进行SDS-PAGE分析和β-半乳糖苷酶活性的测定，KG1/pUC18K-bgaB的β-半乳糖苷酶活力是KG1的33.08倍;10011/pUC18K-bgaB的β-半乳糖苷酶活力是10011的3.45倍。乳糖发酵实验中，10011/pUC18K-bgaB菌株发酵时间缩短了12 h，最大乳糖比消耗速率提高了38.70％，发酵终点2，3-丁二醇产量略高于原菌。KG1/pUC18K-bgaB菌株乳糖消耗速度变慢，发酵结束时，KG1/pUC18K-bgaB的残糖为41.03 g/L。
　　(4)乳糖通透酶活性的测定结果显示，KG1/pUC18K-ElacY酶活力是KG1的2.01倍，10011/pUC18K-ElacY酶活力是10011的1.75倍。乳糖发酵结果显示，KG1/pUC18K-ElacY，10011/pUC18K-ElacY和对应原菌相比，发酵速度分别提高了25.0％和12.5％，最大乳糖比消耗速率分别提高了66.2％和46.7％。说明ElacY基因的过量表达提高了两株基因工程菌对乳糖的利用速度，同时不影响2，3-丁二醇的生成量。
　　(5)乳糖通透酶活性的测定结果显示，KG1/pUC18K-KlacY酶活力是KG1的1.92倍;10011/pUC18K-KlacY酶活力是10011的1.73倍。KG1/pUC18K-KlacY，10011/pUC18K-KlacY对乳糖的利用速度没有提高，2，3-丁二醇的生成量和原菌几乎相同。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 2，3-丁二醇概况

1．1．1 2，3-丁二醇的理化性质

1．1．2 2，3-丁二醇旋光异构体的形成机制

1．1．3 2，3-丁二醇的应用

1．2 生物法生产2，3-丁二醇

1．2．1 菌种

1．2．2 原料

1．2．3 微生物生成2，3-丁二醇的代谢途径

1．2．4 微生物法生产2，3-丁二醇代谢途径的改造

1．3 利用乳糖发酵生产2，3-丁二醇研究进展

1．4 乳糖代谢途径研究进展

1．5 本课题的研究意义与内容

1．5．1 本课题研究的意义

1．5．2 本课题研究的内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要培养基

2．1．5 主要溶液

2．2 实验方法

2．2．1 质粒的构建

2．2．2 菌株构建

2．2．3 种子培养

2．2．4 发酵培养

2．2．5 生长曲线的绘制

2．2．6 SDS-PAGE蛋白电泳

2．3 分析方法

2．3．1 菌体浓度的测定

2．3．2 代谢产物浓度的测定

2．3．3 单位菌体最大乳糖比消耗速率的测定

2．3．4 β-半乳糖苷酶酶活的测定

2．3．5 乳糖通透酶酶活的测定

3 结果与讨论

3．1 外源添加β-半乳糖苷酶发酵实验

3．2 重组质粒的构建

3．2．1 质粒pUC18K-bgaB的构建

3．2．2 质粒pUC18K-ElacY的构建

3．2．3 质粒pUC18K-KlacY的构建

3．3 过量表达bgaB基因对菌株利用乳糖的影响

3．3．1 Kan抗性筛选重组菌株

3．3．2 重组菌株KG1／pUC18K-bgaB、10011／pUC18K-bgaB的构建与验证

3．3．3 过表达bgaB菌株与出发菌株生长速度的比较

3．3．4 过表达bgaB菌株与出发菌株SDS-PAGE的比较

3．3．5 过表达bgaB菌株与出发菌株β-半乳糖苷酶活力的比较

3．3．6 过表达bgaB菌株与出发菌株乳糖消耗速度比较

3．3．7 过表达bgaB菌株与出发菌株最大乳糖比消耗速率的比较

3．3．8 过表达bgaB菌株与出发菌株2，3-丁二醇及副产物产量的比较

3．4 过量表达ElacY基因对菌株利用乳糖的影响

3．4．1 重组菌株KG1／pUC18K-ElacY、10011／pUC18K-ElacY的构建与验证

3．4．2 过表达ElacY菌株与出发菌株生长速度的比较

3．4．3 过表达ElacY菌株与出发菌株乳糖通透酶活力的比较

3．4．4 过表达ElacY菌株与出发菌株乳糖消耗速度比较

3．4．5 过表达ElacY菌株与出发菌株最大乳糖比消耗速率的比较

3．4．6 过表达ElacY菌株与出发菌株2，3-丁二醇及副产物产量的比较

3．5 过量表达KlacY基因对菌株利用乳糖的影响

3．5．1 重组菌株KG1／pUC18K-KlacY、10011／pUC18K-KlacY的构建与验证

3．5．2 过表达KlacY菌株与出发菌株生长速度的比较

3．5．3 过表达KlacY菌株与出发菌株乳糖通透酶活力的比较

3．5．4 过表达KlacY菌株与出发菌株乳糖消耗速度比较

3．5．5 过表达KlacY菌株与出发菌株最大乳糖比消耗速率的比较

3．5．6 过表达KlacY菌株与出发菌株2，3-丁二醇及副产物产量的比较

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢