产α-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选和特性研究及α-半乳糖苷酶基因agaI的克隆和表达

摘要

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，α-D-galactoside galactohydrolase；EC3.2.1.22）也称蜜二糖酶，是一种外切糖苷酶，催化移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶在医疗、食品、化工及饲料等方面都有着广泛的应用前景。在饲料工业中，α-半乳糖苷酶添加剂是去除豆粕中α-半乳糖苷寡糖类抗营养因子的首选方法，但是目前饲用α-半乳糖苷酶的生产目前尚未形成产业化，其中，性质优良的α-半乳糖苷酶的发掘是一个亟待解决的关键问题.乳酸菌作为人们日常生活中的食用添加菌种已有上百年的历史了，尚未见任何明显得副作用，所以我们从此入手研究产α-半乳糖苷酶的乳酸菌，为工业化大规模生产提供一些必要的科学依据。
　　 本实验从分离于泡菜的乳酸菌中筛选出了16株具有α-半乳糖苷酶活性的菌株，分别来源于6个不同的种。从每个种中挑选一株进行了α-半乳糖苷酶的生化特性研究。六株菌的粗酶液均表现出较高的α-半乳糖苷酶活性，其中来源于干酪乳杆菌g4-1最高酶活力达到了19.7 U/ml，所有α-半乳糖苷酶活性的差异明显，都有不同的最适温度和最适pH值。六株菌都能有效的降解棉子糖，其降解产酸能力与酶活性有着直接的联系。
　　 为了进一步克隆表达α-半乳糖苷酶基因的需要，我们挑选了g4-1作为研究对象，对其粗酶液的α-半乳糖苷酶温度、pH的稳定性及金属离子Cu2+，Fe2+，Cd2+，Ni+，Zn2+，Mg2+的影响进行了研究.实验结果表明g4-1α-半乳糖苷酶高温不稳定，酶活对pH比较敏感，在pH5以下及pH8以上α-半乳糖苷酶稳定性较差，在pH5-8之间保存一小时，酶活均达到50％以上。大多数金属离子对酶活性没有很大影响，只有Ni+使酶活性降到45.27％。
　　 利用Cazy数据库中已登录的干酪乳杆菌的α-半乳糖苷酶的序列进行了比对，设计了两条特异性引物，PCR扩增出了一条大小为2292bp的agaI基因，将该基因连接到pET-29a上，在E.coil BL21中进行了重组表达。BL21-PA8重组粗酶液的酶活力高达18.8U/ml。

目录

文摘

英文文摘

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

1.α-半乳糖苷酶的研究进展

1.1 α-半乳糖苷酶的概述

1.2 α-半乳糖苷酶的来源

1.3 α-半乳糖苷酶的酶学特性

1.4 α-半乳糖苷酶的分类

1.5 α-半乳糖苷酶的分子特性

1.6 α-半乳糖苷酶的表达与调控

1.7 α-半乳糖苷酶的结构与功能

1.8 α-半乳糖苷酶基因的表达系统

2.α-半乳糖苷酶的应用

2.1 α-半乳糖苷酶的医学研究进展

2.2 α-半乳糖苷酶在食品工业上的应用

2.3 α-半乳糖苷酶在豆粕饲料中的应用

第二章 α-半乳糖苷酶的乳酸菌筛选及其酶的特性研究

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选

2.2 六株菌α-半乳糖苷酶特性研究

2.3 产酸能力

2.4 高产酶菌株g4-1α-半乳糖苷酶的pH和温度的稳定性

2.5 金属离子对高产酶菌株g4-1α-半乳糖苷酶活性的影响

3.本章小结与讨论

第三章 干酪乳杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 干酪乳杆菌g4-1总DNA的提取

2.2 aga Ⅰ基因的TA克隆

2.3 表达系统pET-29a-aga/的构建

2.4 阳性克隆pET-29a-aga/的诱导表达

2.4 阳性克隆pET-29a-aga/的低温诱导表达

3.本章小结

全文参考文献

全文结论

创新之处

存在问题与展望

附录:agaⅠ序列

致 谢