单增李斯特菌表面增强拉曼光谱检测技术研究

摘要

单增李斯特菌可以经过肉类、乳制品等引起细菌性食品中毒，是危害人类健康、威胁公共安全的重要病原体。因此及时发现食品中的污染病原菌十分重要，开发一种快速可靠的检测食源性致病菌的方法已经成为食品卫生行业不可或缺的关键环节。近几年来，表面增强拉曼光谱技术因具有高效、快速、无损、操作简单等优点而广泛应用于农业、食品、化学、等领域。本文建立了一种拉曼光谱结合化学计量学分析快速检测单增李斯特菌的方法。
　　本研究中首先对所有试验菌株进行16SrDNA测序验证其正确性后，利用无监督聚类分析研究了不同培养条件对李斯特菌拉曼光谱的影响。然后利用拉曼光谱结合无监督和有监督两种判别分析方法对4种常见食源性致病菌:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌进行革兰氏类型、属水平和种水平区分。在此基础上，通过人为接种6种李斯特菌于市售无菌牛奶中，对实际样本中单增李斯特菌进行检测分析。此外，本研究中还利用拉曼光谱技术结合偏最小二乘回归分析对混合菌中的单增李斯特菌进行定量检测。本研究结果表明，不同培养条件对菌株表面分子组成造成的差异大于相同条件下不同菌株本身的差异;拉曼光谱能对4种常见食源性致病菌在革兰氏类型、属水平和种水平进行正确区分，有监督的距离判别分析和贝叶斯判别分析总体平均正确率分别为97.4％和98.8％;实际样本检测中，拉曼光谱能将单增李斯特菌与其他非致病李斯特菌正确区分开来，有监督的判别分析平均识别率均在95％以上。本研究所建立的偏最小二乘回归分析模型能够定量检测混合菌中的单增李斯特菌，经过优化选择，交互验证决定系数R2＞0.97，交互验证校正标准差＜0.6。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 拉曼与表面增强拉曼光谱技术

1．1．1 拉曼与表面增强拉曼光谱的简介

1．1．2 拉曼光谱的原理

1．1．3 共聚焦激光拉曼光谱仪

1．2 化学计量学方法

1．2．1 概述

1．2．2 光谱预处理方法

1．2．3 模式识别方法

1．2．4 偏最小二乘回归分析

1．3 单增李斯特菌简介

1．3．1 李斯特菌简介

1．3．2 单增李斯特菌检测方法研究进展

1．4 拉曼光谱技术对食源性致病菌检测的研究进展

1．5 本论文研究意义及研究内容

2 材料与方法

2．1 实验菌株

2．2 实验仪器及材料

2．3 实验菌株的鉴定

2．3．1 细菌基因组提取

2．3．2 特异引物扩增16SrDNA序列

2．3．3 纯化PCR产物

2．3．4 DNA测序获得16SrDNA序列

2．3．5 与数据库中已知细菌比较获得样品种属信息

2．4 李斯特菌生长曲线的绘制

2．5 扫描电镜表征

2．6 拉曼测试样品的制备

2．6．1 不同培养条件菌株培养制备

2．6．2 拉曼光谱对李斯特菌检测方法初步研究

2．6．3 拉曼光谱对混合菌检测方法研究

2．6．4 牛奶中李斯特菌的定性检测

2．6．5 牛奶中李斯特菌的增菌检测

2．7 仪器实验条件

2．8 拉曼光谱分析

2．8．1 光谱预处理

2．8．2 多元统计分析

3 结果与讨论

3．1 菌种16SrDNA鉴定

3．1．1 16SrDNA的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

3．1．2 测序及NCBI blast结果

3．2 李斯特菌生长曲线

3．3 扫描电镜表征

3．4 不同培养条件下李斯特菌的拉曼光谱图分析

3．5 拉曼光谱检测李斯特菌的初步研究

3．5．1 常见致病菌原始拉曼光谱图比较

3．5．2 峰位归属

3．5．3 三水平分类模型的建立

3．6 拉曼光谱对混合菌检测

3．6．1 波段的选择优化

3．6．2 光谱预处理方法的选择

3．6．3 PLSR模型的优化

3．6．4 PLSR模型的建立

3．7 牛奶中李斯特菌的定性检测

3．7．1 光谱重现性

3．7．2 李斯特菌拉曼光谱峰位分析

3．7．3 统计分类模型

3．8 牛奶中李斯特菌的增菌检测

4 结论

5 展望

参考文献

致谢