杂色鲍抗副溶血弧菌血细胞ESTs分析及免疫功能基因的克隆

摘要

本文以本实验室构建的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染的杂色鲍(Haliotisdiversicolor)血细胞cDNA文库为材料,对文库进行扩增并经随机筛选后共测序4758条序列,经生物信息学初步处理后得到高质量的表达序列标签(Expressed Sequence Taqs,ESTs)4264条。拼接后获得3638条唯一序列(unique sequences),其中重叠群(contigs)和单一序列(singlets)分别为484条和3154条;冗余率为14.68％。3638条唯一序列用Blast2go软件进行注释。Blast注释后,发现有398条(10.9％)EST在GenBank的非冗余蛋白库找到了同源序列。GO注释后发现这398个基因聚类有340个可归类于细胞组分、生物学过程和分子功能。InterProScan注释后,发现有950条序列可以找到同源序列,其中71条获得了酶学编码。将获得了酶学编码的71条序列在KEGG中的Pathway数据库进行注释,发现参与代谢途径和氧化磷酸化的序列最多。我们对具有同源序列的基因进行了人工功能分析,发现了35种(8.8％)与免疫相关的基因。结合EST序列分析、SMART RACE技术和基因组步移(Genome Walking)技术获得杂色鲍(small abalone)半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteases inhibitor或cystatin,CPI)和脂多糖诱导的肿瘤坏死因子a因子(LPS-induced TNF-a factor,LITAF)基因的全长cDNA,分别命名为sacp、sacpi和salitaf,之后用head to toe PCR检测cDNA序列开放阅读框的正确性,并采用实时定量PCR分析这些基因的组织表达及经副溶血弧菌感染后的表达情况。结果如下:1)杂色鲍sacp cDNA全长1558bp,开放阅读框编码303个氨基酸,包含两个CP活性位点。经Blast同源性分析,发现其为组织蛋白酶(cathepsin)L型。2)杂色鲍sacpi序列全长1481bp,编码253个氨基酸,包含一个CPI特征基序及Ⅱ型CPI激活位点的共有序列:Gly63,Q84VVSG88和P114W115。经TFSEARCH在线预测,杂色鲍sacpi的5'侧翼序列存在HSF、BR-C Z3、NIT2、Oct-1、CdxA、MyoD、deltaEF1、ADR1、MATal、GATA-1、C/EBPbeta、SRY和Sox-5等转录因子结合位点。3)salitaf基因cDNA序列全长为726bp,开放阅读框编码78个氨基酸,包含两个LITAF特征性的N-端、C-端Zn2+结合域。4)sacp基因在性腺、鳃、肝胰腺、外套膜、上足、肌肉和血细胞七个组织中均有表达,在性腺、鳃和肝胰腺中,表达量最高。Sacpi基因主要在性腺和肝胰腺中表达,在其他组织中不表达或表达量很低。Salitaf基因在七个组织中都有表达,在鳃中的表达量最高,其次是上足和外套膜。5)弧菌感染后24h,sacp基因在肝胰腺显著上调表达(p＜0.05),感染48h后,表达量回降;sacpi基因在感染48h后,在肝胰腺显著上调表达(p＜0.05),提示了sacpi对sacp的内源性抑制;而satitaf基因感染48h后,在肝胰腺显著上调表达(p＜0.05),96h后,显著下调表达(p＜0.05)。6)感染弧菌后sacp基因在血细胞中的表达,各个时相实验组和对照组都没有显著性差异(p＞0.05)。感染8h后,salitaf基因在血细胞中显著下调表达(p＜0.05),之后回升至稳定水平。7)Real-time PCR检测免疫相关基因sacp、sacpi、salitaf在杂色鲍濒死组与对照组肝胰腺中的表达情况,发现sacp基因在濒死组杂色鲍肝胰腺中会极显著上调表达(p＜0.01),而sacpi和salitaf基因则显著上调表达(p＜0.05)。