杂色鲍MNK、IRR和FGFR基因的克隆、表达分析及与生长相关的SNP位点筛查

摘要

杂色鲍(Haliotis diversicolor)是我国南方重要的养殖鲍种，研究与杂色鲍生长相关的基因，分析基因的表达规律，并筛查基因中与生长性状相关联的SNP位点，对于深入了解生长性状调控的分子机制，培育具有优良性状的新品种具有重要意义。本研究将MAPK互作激酶(MAP kinase-interacting kinase，MNK)、胰岛素相关多肽受体(Insulin-related peptide receptor, IRR)和成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor, FGFR)三个基因作为杂色鲍生长的候选基因，通过对其克隆、功能验证、SNP位点检测及与生长性状的关联分析，筛选出对杂色鲍生长性状有重要影响的功能分子标记，以期为杂色鲍的分子标记辅助选择育种提供重要依据。主要结果如下:
　　1、利用PCR及末端快速扩增技术（RACE）技术，克隆获得MNK基因的cDNA全长序列及开放阅读框（ORF）区域的基因组DNA序列。MNK基因cDNA全长3576bp，ORF长1413bp，ORF区的基因组DNA序列长3942bp，包含6个外显子和5个内含子。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示，MNK基因在所测的幼体/胚胎不同发育阶段及成体不同组织都有表达，胚胎时期表达量显著高于破膜后幼体时期的表达量，在成体精巢组织中表达量最高，在鳃中表达量最低。通过整体原位杂交实验发现，MNK基因在原肠胚时期至围口壳幼体时期均有表达，担轮幼体时期和面盘幼体早期，MNK基因主要在壳腺区域表达，面盘幼体中期主要在内脏团和贝壳处表达，面盘幼体后期，表达部位分布在内脏团和外套膜区，到达围口壳幼体时期，开始在消化腺、外套膜和足部大量表达。利用高通量测序手段在6个包含MNK外显子的片段中共筛选获得了5个与杂色鲍生长性状相关的SNP位点。选择与足肌重量和壳的生长性状均显著相关的位点A1748C，分析MNK基因在该位点三种基因型的足肌和外套膜中表达量的相互关系，发现足肌重量及壳长、壳宽、壳高、壳重值最高的CC型个体中MNK基因在足肌和外套膜中的表达量最高，而生长性状平均值最低的AA型个体，MNK基因在足肌和外套膜中的表达量最低，说明A1748C中等位基因C可能促进足肌肉及壳的生长。
　　2、利用PCR技术及RACE技术，克隆获得IRR基因的cDNA全长序列及 ORF区的部分基因组DNA序列。IRR基因cDNA全长5723bp，ORF长3054bp，已获得的ORF区的部分基因组DNA包含18个外显子。通过qRT-PCR检测了IRR基因在杂色鲍胚胎/幼体不同发育时期及成体不同组织的表达情况，发现杂色鲍IRR基因在幼体各发育阶段都有表达，在胚胎发育时期表达量较高，原肠胚时期和早期担轮幼体时期达到最高，担轮幼体时期表达量有所降低，从面盘幼体时期至围口壳幼体时期，表达量显著下降。IRR基因在成体各组织中均有表达，在精巢中表达量最高，在卵巢中表达量最低。整体原位杂交结果显示，IRR基因从原肠胚时期开始表达，担轮幼体期，IRR基因在后毛轮区表达，面盘幼体早期，开始在壳腺处表达，面盘幼体中期，表达部位分布在内脏团和贝壳处，至面盘幼体后期，信号增强，主要集中于内脏团区，到达围口壳幼体时期，IRR基因在消化腺表达量减少，并开始在外套膜和足部表达。利用高通量测序手段在18个包含IRR外显子的片段中共筛选获得了17个与杂色鲍生长性状相关的SNP位点。其中8个位点与所测的杂色鲍性状均明显相关，其余位点与一个或几个生长性状相关联。选择与足肌重量和壳的生长性状均显著相关的A2198T位点，分析IRR基因在该位点三种基因型的足肌和外套膜中表达量的相互关系，发现足肌重量及壳长、壳宽、壳高、壳重值最高的AA型个体中，IRR基因在足肌和外套膜中表达量最高，而生长性状平均值最低的TT型个体，IRR基因在足肌和外套膜中的表达量最低。进一步验证了A2198T位点与杂色鲍生长性状的相关性。
　　3、利用普通PCR技术及RACE技术获得了FGFR基因的cDNA全长序列及ORF区的部分基因组DNA序列。FGFR基因cDNA全长5059 bp，ORF长3729bp，ORF区基因组DNA中的外显子已全部获得，共包含23个外显子。通过qRT-PCR检测了FGFR在杂色鲍胚胎/幼体不同发育时期及成体不同组织的表达情况，发现FGFR基因在所测的幼体/胚胎不同发育阶段均有表达，在受精卵时期表达量较高，2细胞期开始降低，至围口壳幼体时期表达量又显著升高。在杂色鲍成体各组织中，FGFR基因在鳃、外套膜、肝胰腺、足肌、精巢组织中均有表达，其中，鳃和外套膜中表达量最高，而在卵巢和血淋巴中几乎不表达。利用高通量测序手段在24个包含FGFR外显子的片段中共筛选获得了21个与杂色鲍生长性状相关的SNP位点。选择与杂色鲍壳的生长性状显著相关的位点T15641G，分析FGFR基因在该位点三种基因型外套膜中的表达水平，发现在壳长、壳宽、壳重值最高的TT型个体中，FGFR基因的表达量最低，而在壳长、壳宽、壳重值最低的GG型个体中，该基因的表达量反而最高，TG型个体壳的生长性状值及表达量均介于TT型个GG型个体之间。提示杂色鲍FGFR基因可能参与贝壳形成的负性调控。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 几种生长相关基因的研究进展

1．2．1 MAPK互作激酶

1．2．2 胰岛素受体家族

1．2．3 成纤维细胞生长因子及其受体

1．3 DNA分子标记技术的种类和特征

1．3．1 第一代分子标记技术

1．3．2 第二代分子标记技术

1．3．3 第三代分子标记技术

1．4 本研究的研究意义

第二章 杂色鲍MNK基因克隆、表达分析及生长相关的SNP位点筛查

前言

第一节 杂色鲍MNK基因的克隆

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

第二节 杂色鲍MNK基因的时空表达分析

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

第三节 MNK基因生长性状相关的SNP位点的筛查

2．3．1 材料与方法

2．3．2 结果

2．3．3 讨论

第三章 杂色鲍IRR基因克隆、表达分析及生长相关的SNP位点筛查

前言

第一节 杂色鲍IRR基因的克隆

3．1．1 材料与方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

第二节 杂色鲍IRR基因的时空表达分析

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

第三节 IRR基因生长性状相关的SNP位点的筛查

3．3．1 材料与方法

3．3．2 结果

3．3．3 讨论

第四章 杂色鲍FGFR基因克隆、表达分析及生长相关的SNP位点筛查

前言

第一节 杂色鲍FGFR基因的克隆

4．1．1 材料与方法

4．1．2 结果

4．1．3 讨论

第二节 杂色鲍FGFR基因的表达分析

4．2．1 材料与方法

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

第三节 FGFR基因生长性状相关的SNP位点的筛查

4．3．1 材料与方法

4．3．2 结果

4．3．3 讨论

第五章 结论与创新点

5．1 主要结论

5．2 创新点

5．3 研究展望

致谢

参考文献

附录