2709碱性蛋白酶水解肽谱的动态研究

摘要

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，在食品、酿造和医药等工业领域具有广泛的应用，蛋白酶对蛋白质氨基酸序列的水解，在酶切位点的选择上具有不同程度的特异性。微生物来源的蛋白酶，如2709碱性蛋白酶，是位点特异性比较弱的蛋白酶，其酶切肽谱的规律尚未有报道过，其肽谱的分析也不能采用目前广泛应用的位点特异性酶切肽谱鉴定方法。位点非特异性酶切肽谱鉴定方法，不依赖特异的酶切位点，因此更适合于位点特异性比较弱的多数工业蛋白酶制剂，但是该方法的可靠性和鉴定肽谱的能力尚缺乏深入的评价。研究蛋白酶水解蛋白获得的肽谱，对于深入了解蛋白酶的水解特性及促进其在食品工业上的应用具有重要的作用。本论文在位点非特异性酶切肽谱分析方法建立、2709碱性蛋白酶的纯化及其水解大豆蛋白的肽谱变化规律方面做了研究，主要研究如下:
　　首先，本研究通过对牛血清白蛋白和大豆蛋白的胰蛋白酶水解物的分析，从单一种类蛋白和混合蛋白两个层次上，比较了位点非特异性肽谱鉴定方法与位点特异性肽谱鉴定方法。相比位点特异性肽谱鉴定方法，位点非特异性肽谱鉴定方法从牛血清白蛋白水解物中鉴定的肽段数量提高了23％，从大豆蛋白水解物中鉴定的肽段数量提高了54％，证明该方法能够获得更多的肽谱信息，具有更强的肽谱覆盖能力，且对位点特异性肽谱鉴定方法肽谱结果的重现率平均达到了98％以上，证明了该方法同样具有较高的可靠性。
　　其次，本论文分别通过硫酸铵盐析、疏水层析、离子交换层析等方法纯化了2709碱性蛋白酶。纯化后的比酶活达到了8540u/mg，经SDS蛋白凝胶电泳检测达到了很高的纯度。
　　最后，采用位点非特异性酶切肽谱分析，分别研究了碱性蛋白酶酶解BSA和大豆分离蛋白过程中肽谱的动态变化规律，结果表明2709碱性蛋白酶具有极强的水解能力和较宽泛的水解位点选择性，揭示了该酶酶解BSA蛋白和大豆分离蛋白过程中肽谱变化的复杂性和水解位点选择的倾向性。
　　本论文为工业蛋白酶水解肽谱的研究奠定了方法学基础，并有助于提高我国工业蛋白酶制剂的应用水平和蛋白质加工水平。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 微生物源碱性蛋白酶及其工业应用

1．2 蛋白酶水解制备生物活性肽

1．3 蛋白酶分离纯化方法的研究进展

1．3．1 蛋白酶粗提方法

1．3．2 层析法精制蛋白酶

1．4 蛋白酶酶解特性研究

1．4．1 蛋白酶酶解特性

1．4．2 以多肽为核心的质谱方法分析蛋白酶的酶解特性

1．4．3 蛋白质为核心的质谱分析方法分析蛋白酶的酶解特性

1．4．4 荧光肽库法分析蛋白酶的酶解特性

1．5 蛋白质水解肽谱的鉴定方法

1．6 微生物源工业蛋白酶水解肽谱特性的研究进展

1．7 本课题研究意义与研究内容

1．7．1 本课题研究意义

1．7．2 本课题的研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验试剂

2．1．2 实验仪器

2．1．3 溶液

2．2 方法

2．2．1 酶活力测定

2．2．2 蛋白含量的测定

2．2．3 盐析法粗提2709碱性蛋白酶

2．2．4 2709碱性蛋白酶的分离纯化方法

2．2．5 SDS-PAGE电泳检测纯化后的蛋白纯度

2．2．6 蛋白酶切方法

2．2．7 LC-MS＼MS分析方法

2．2．8 位点特异性酶切肽谱分析方法

2．2．9 位点非特异性酶切肽谱分析方法

3 结果与讨论

3．1 位点非特异性酶切肽谱分析方法的研究

3．1．1 胰蛋白酶酶切BSA所得肽谱的分析

3．1．2 胰蛋白酶酶解大豆分离蛋白所得肽谱的分析

3．2 2709碱性蛋白酶的分离纯化

3．2．1 硫酸铵沉淀法纯化2709碱性蛋白酶

3．2．2 疏水层析法纯化2709碱性蛋白酶

3．2．3 离子交换层析法纯化2709碱性蛋白酶

3．2．4 SDS- PAGE检测2709碱性蛋白酶纯化后的纯度

3．3 2709碱性蛋白酶酶解BSA所得肽谱的动态分析

3．3．1 SDS聚丙烯酰胺电泳分析BSA蛋白降解情况

3．3．2 LC／MS-MS法分析BSA蛋白酶切肽谱的变化

3．3．3 酶切位点的氨基酸种类及其频率分析

3．4 2709碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白所得肽谱的动态分析

3．4．1 碱性蛋白酶酶解大豆蛋白过程中的分子量变化及肽段变化分析

3．4．2 碱性蛋白酶酶解大豆蛋白过程中酶切位点的分析

3．4．3 碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白2．5h后肽谱分析

3．4．4 2709碱性蛋白酶酶解特性的分析

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士论文发表论文情况

致谢