富硒古尼虫草菌发酵条件优化及活性成分研究

摘要

硒(Se)是人体必需微量元素之一，是含硒酶的重要组分，具有多种生理功能。而我国处于低硒区，硒的营养补充显得尤为重要。由于虫草菌具有硒元素的有机转换能力，富硒后，其提取物硒多糖兼有多糖和硒的双重活性，然而有关古尼虫草菌丝体富硒及其硒多糖的研究鲜有报道。本论文研究了古尼虫草菌的耐硒和富硒特征，以富硒率和生物量为指标进行液体发酵条件优化，从富硒古尼虫草菌丝体中提取多糖并进行结构和抗氧化活性分析。
　　固体平板培养观察富硒古尼虫草菌的菌落特征和形态。实验结果显示，固体平板培养耐亚硒酸钠浓度为5μg/mL，且富硒能够加快古尼虫草菌丝体的生长，减慢菌种老化速度。菌落整体为白色，菌落四周长满较短的白色绒状致密菌丝;分生孢子无隔膜，呈拟卵圆形、椭圆形，平滑、均匀的粘附在产孢结构上。
　　采用原子荧光法测定富硒菌丝体中的硒含量，通过单因素及正交试验优化液体发酵条件。结果表明:液体发酵耐亚硒酸钠浓度为7μg/mL;最优发酵条件为:蔗糖浓度6％，蛋白胨浓度0.6％，KH2PO40.25％，MgSO40.20％，培养基初始pH6.0，培养温度25℃，接种量8％。在此条件下，富硒古尼虫草生物量可达11.657g/L，富硒率可达78.33％。为探究生物富硒对古尼虫草功效成分和营养成分的影响，测定了基础组和富硒组中化学成分的含量，结果显示富硒古尼虫草菌四种营养和三种功效成分含量高于基础古尼虫草，且多糖含量达到了10.39％。
　　分别从基础组和富硒组菌丝体中提取、分离和纯化得分子量均一的大分子多糖，分别命名为CCPS-Ⅱ（基础组）和SeCPS-Ⅱ（富硒组）。结果为:SeCPS-Ⅱ和CCPS-Ⅱ中硒含量分别为17.89μg/g和2.01μg/g。采用气相色谱、高碘酸氧化、Smith降解和核磁共振等分析表明，两种多糖的单糖组成种类一样，主要由葡萄糖组成，但单糖含量不同;CCPS-Ⅱ糖残基呈α异头构型，且由α(1→4)葡萄糖构成多糖骨架，SeCPS-Ⅱ糖残基主要呈α异头构型，还含有部分β异头构型，且主要由α(1→4)葡萄糖构成多糖骨架，部分β-型糖苷键构成多糖支链。通过红外光谱对结构进行表征，初步推断SeCPS-Ⅱ含有亚硒酸酯的特征吸收峰。使用旋光仪、刚果红试验和X-射线衍射仪对CCPS-Ⅱ和SeCPS-Ⅱ进行结构分析，结果显示富硒对其多糖结构有一定影响。
　　通过体外抗氧化试验评价CCPS-Ⅱ和SeCPS-Ⅱ对自由基的清除能力。当多糖浓度为3.0mg/mL时，与CCPS-Ⅱ相比，SeCPS-Ⅱ对羟自由基、DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基清除率分别提高了21.07％、3.64％、14.38％和15.63％，实验表明硒多糖具有较好的抗氧化能力。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 虫草属真菌概况

1．2 古尼虫草的研究概述

1．2．1 古尼虫草的生物学特性

1．2．2 古尼虫草化学成分研究

1．2．3 古尼虫草的药理作用

1．3 硒的研究概述

1．3．1 硒的分布及存在形式

1．3．2 硒对人体健康的影响

1．3．3 人体硒的需要量

1．3．4 富硒产品的开发与研究现状

1．4 硒多糖的研究概况

1．4．1 硒多糖的种类和来源

1．4．2 硒多糖的提取、分离和纯化

1．4．3 硒多糖的结构

1．4．4 硒多糖的生物活性

1．5 研究的目的、意义及主要内容

1．5．1 研究目的和意义

1．5．2 研究的主要内容

2 材料和方法

2．1 实验材料、试剂与仪器

2．1．1 实验菌种

2．1．2 实验药品和试剂

2．1．3 实验仪器和设备

2．1．4 培养基

2．2 培养方法

2．2．1 菌株活化

2．2．2 种子液培养

2．2．3 液体摇床发酵培养

2．3 分析和测定方法

2．3．1 菌丝体生物量的测定

2．3．2 硒含量测定和富硒率的计算

2．3．3 古尼虫草菌丝体有效成分分析

2．4 古尼虫草菌耐硒特征实验

2．4．1 古尼虫草菌固体培养耐硒实验

2．4．2 古尼虫草菌液体培养耐硒实验

2．4．3 生长曲线的测定

2．5 富硒古尼虫草菌液体发酵条件的优化

2．5．1 液体发酵中营养条件的优化

2．5．2 液体发酵过程中环境条件的优化

2．6 CCPS-Ⅱ和SeCPS-Ⅱ的结构分析

2．6．1 菌丝体多糖提取

2．6．2 多糖的分子量分布

2．6．3 多糖的分离纯化

2．6．4 多糖的纯度鉴定

2．6．5 多糖的比旋光度测定

2．6．6 多糖的红外光谱分析

2．6．7 多糖的核磁共振分析

2．6．8 多糖的单糖组成分析

2．6．9 高碘酸氧化和Smith降解分析

2．6．10 多糖的刚果红试验

2．6．11 多糖的X射线衍射分析

2．7 CCPS-Ⅱ和SeCPS-Ⅱ的体外抗氧化活性研究

2．7．1 主要试剂和溶液的配制

2．7．2 羟自由基(·OH)清除能力的测定

2．7．3 超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力的测定

2．7．4 DPPH自由基清除能力测定

2．7．5 ABTS自由基清除能力测定

3 结果与讨论

3．1 古尼虫草菌耐硒特征实验

3．1．1 古尼虫草菌固体培养耐硒实验

3．1．2 古尼虫草菌液体发酵耐硒实验

3．1．3 液体发酵生长曲线实验

3．2 富硒古尼虫草菌液体发酵条件研究

3．2．1 发酵过程中营养条件对富硒率和生物量的影响

3．2．2 发酵过程中环境条件对富硒率和生物量的影响

3．2．3 最佳发酵条件下富硒古尼虫草菌摇瓶发酵实验

3．3 生物富硒对古尼虫草菌化学成分的影响

3．3．1 多糖含量分析

3．3．2 菌丝体营养成分比较

3．3．3 菌丝体功效成分比较

3．4 多糖的纯化和结构分析

3．4．1 多糖的提取和纯化

3．4．2 多糖含量测定

3．4．3 多糖纯度的鉴定

3．4．4 多糖的分子量测定

3．4．5 多糖的硒含量测定

3．4．6 多糖的比旋光度分析

3．4．7 多糖的红外光谱分析

3．4．8 多糖的核磁共振图谱分析

3．4．9 多糖的单糖组成分析

3．4．10 CCPS-Ⅱ和SeCPS-Ⅱ连接方式分析

3．4．11 刚果红试验

3．4．12 多糖的X射线衍射分析

3．5 CCPS-Ⅱ和SeCPS-Ⅱ的体外抗氧化活性实验结果

3．5．1 对羟自由基(·OH)的清除

3．5．2 对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除

3．5．3 对DPPH自由基的清除

3．5．4 对ABTS自由基的清除

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢