耐乙醇巴氏醋杆菌的构建及其胞内代谢物研究

摘要

食醋发酵中，醋酸菌不可避免地受到乙醇、乙酸以及高温等环境因素的胁迫，会严重影响其发酵速率，发酵效率及其产量，同时也会增加生产成本。乙醇作为醋酸菌的发酵底物，不仅影响发酵效率、食醋产量，对醋酸菌自身的生长也会造成影响。本文尝试利用分子生物学的方法，对常用的食醋酿造菌巴氏醋杆菌（Acetobacterpasteurianus）进行改造，成功构建出一株具有一定乙醇耐受性能的工程菌株。并对其进行了发酵性能检测和代谢组学研究，为进一步探讨乙醇耐受机制及改造菌种提供了依据。
　　据相关文献报道编码磷酸组氨醇氨基转移酶的hisl基因与乙醇的耐受性相关。根据已公布的hisl基因序列的信息设计引物，以沪酿1.01菌株(AP)的基因组DNA为模板扩增出目的片段，构建了重组质粒，并导入到巴氏醋杆菌中成功构建了能够耐受高浓度乙醇的工程菌株T1。在9％(v/v)乙醇浓度的发酵条件下，其醋酸产量达到37.66±1.51g/L，比原始菌株AP的产量（12.93±2.89 g/L）提高了191.07％。
　　利用基于气相色谱-质谱联用(GC/MS)的代谢组学，分析了工程菌株与原始菌株在高浓度乙醇发酵条件下的胞内代谢物变化，并对其乙醇耐受机制进行了初步探讨。代谢组学分析结果表明，乙醇胁迫下T1细胞中碳代谢、脂代谢和氨基酸代谢相关物质含量发生了改变。在乙醇胁迫条件下，菌株的糖酵解途径与三羧酸循环受到不同程度地抑制，但工程菌株T1在乙醇胁迫下仍能维持较高的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶酶活，使其乙醇氧化产能途径能很好地运行，为菌体提供足够的能量，维持细胞生长，来抵抗外界不利因素。同时菌体内合成了大量的脯氨酸、谷氨酸和海藻糖等细胞保护性物质，对菌体自身起到保护作用。乙醇胁迫下菌体中饱和脂肪酸的合成会受到抑制，不饱和脂肪酸含量增加，使得饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸比值减小，表明乙醇浓度会改变细胞膜流动性。在乙醇胁迫下菌株T1能够有效地调节自身脂肪酸的合成，减小膜的流动性。乙醇胁迫下T1细胞膜脂肪酸的调节主要是通过调节十六烷酸、十八烷酸和油酸的合成量。
　　综上所述，与原始菌株AP相比，在高乙醇浓度下工程菌株T1的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶仍能保持较高的活力保证了乙醇呼吸链的产能，并且菌株T1能够有效地调节菌体内的碳代谢、脂代谢和氨基酸代谢同时合成细胞活性保护物质，调节自身细胞膜组成并降低其流动性。本研究为进一步改造菌种奠定了一定的基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 食醋概述

1．1．1 食醋功能简介

1．1．2 食醋发酵工艺

1．2 醋酸菌简介

1．3 耐乙醇醋酸菌的选育和改造

1．4 乙醇耐受机制研究

1．5 代谢组学

1．5．1 代谢组学概述

1．5．2 统计学分析方法

1．5．3 代谢组学的应用

1．6 论文研究内容与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 培养条件

2．1．4 质粒

2．1．5 引物

2．2 仪器与试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要溶液及缓冲液

2．3 实验方法

2．3．1 巴氏醋杆菌的培养方法

2．3．2 大肠杆菌E．coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化方法

2．3．3 巴氏醋杆菌感受态细胞的制备及电击转化

2．3．4 耐受乙醇巴氏醋杆菌工程菌株的构建

2．3．5 工程菌株与亲本菌株在高浓度乙醇条件下的发酵性能比较

2．3．6 通过GC-MS代谢组学分析方法对菌株的乙醇耐受机制进行研究

2．4 分析方法

2．4．1 产酸量测定

2．4．2 乙醇浓度的测定

2．4．3 乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶酶活测定

2．4．4 菌体生物量的测定

3 结果与讨论

3．1 耐受乙醇的巴氏醋杆菌工程菌株的构建

3．1．1 hisl基因的克隆

3．1．2 重组质粒pMD18T-hisl和pMV24-hisl的构建

3．1．3 重组质粒pMV24-hisl在E-coli BL21(DE3)中的表达

3．1．4 重组质粒pMV24-hisl在巴氏醋杆菌A．pasteurianus HN101中的表达

3．2 工程菌株的遗传稳定性实验

3．3 不同乙醇浓度下菌株的生长情况及产酸量变化

3．4 工程菌株的产酸稳定性试验

3．5 工程菌株与亲本菌株在9％(v／v)乙醇浓度发酵条件下的发酵性能比较

3．5．1 工程菌株与亲本菌株的吸光度、pH值、产酸量变化

3．5．2 工程菌株与亲本菌株的残糖、残醇变化及其转化率

3．5．3 工程菌株与亲本菌株的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶酶活

3．5．4 小结

3．6 工程菌株与亲本菌株胞内小分子代谢物分析比较

3．6．1 胞内代谢物的检测与定性定量分析

3．6．2 工程菌株和亲本菌株胞内代谢物多元统计分析

3．6．3 结合代谢网络分析

3．6．4 小结

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢

附录