出芽短梗霉AP-35选育及发酵木糖产普鲁兰糖初步研究

摘要

木糖是纤维素类物质中含量仅次于葡萄糖的第二大糖类物质，将木糖转化为高附加值的产品，对于纤维素类物质的充分利用具有重要意义。普鲁兰多糖具有无毒无害和较好的成膜特性，在食品医药行业被广泛利用。本文构建了双波长分光光度法同时测定发酵液中多糖量与木糖量的方法。通过NTG诱变获得高产普鲁兰多糖的菌株AP-35，构建了出芽短梗霉菌株AP-35利用木糖产普鲁兰多糖的代谢通量模型和发酵动力学模型。主要实验结果如下:
　　建立了以间苯三酚-浓硫酸为显色剂，双波长分光光度法同时测定利用木糖产普鲁兰多糖发酵液中产物与底物量的方法。显色剂配方为2％的间苯三酚乙醇溶液与浓硫酸1∶1混合。木糖的测定波长为444nm和405nm，普鲁兰多糖的测定波长为420nm和465nm。测定条件为1mL底物，加入5mL显色剂，沸水浴10min，冷却至室温，加入10mL蒸馏水混匀。葡萄糖与木糖浓度在10μg/mL-300μg/mL浓度范围内线性关系良好。重复性实验得到普鲁兰多糖和木糖的RSD％分别为1.56％和2.42％，加标回收实验得到普鲁兰多糖和木糖的回收率分别在92.53％-100.34％和96.95％-103.84％之间，相对标准偏差分别为3.61％和3.46％。结果表明此方法能够用于多糖与木糖含量的同时测定。
　　通过NTG诱变，选育出一株利用木糖能力较强，多糖产量较高的菌株AP-35。与原菌相比，多糖产量提高了16.55％。通过氮源成分和含量优化，最终无机氮源为NH4NO3，含量为0.42g/L，有机氮源为玉米浆，含量为3.33g/L。通过优化，最终多糖产量为20.51g/L，与氮源优化前相比提高了26.51％。
　　构建了菌株AP-35利用木糖发酵生产普鲁兰多糖过程代谢通量模型，对进一步提高多糖产量具有指导意义。通过分析实际条件和假设条件下的代谢流量分布，得出与多糖合成的两个关键节点分别为六磷酸果糖和丙酮酸，引入溶氧量扰动对两个关键节点进行了分析。通过分析六磷酸果糖节点得到，溶氧量较低时用于合成一六二磷酸果糖的流量多于合成普鲁兰多糖流量。通过分析丙酮酸节点得到溶氧较低时，用来生成草酰乙酸等副产物的流量较多，进而可能用于合成苹果酸。后期可通过适当提高溶氧和弱化一六二磷酸果糖、草酰乙酸合成途径来提高多糖产量。
　　采用Logistic和Luedeking-Piret模型构建了菌株AP-35发酵过程木糖消耗，菌体生成和产物合成的发酵动力学模型，得到了各发酵过程的拟合方程。通过实验验证了该模型对发酵过程中各参数的变化具有较好的预测作用，能够对后期发酵进行指导。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 微生物多糖简介

1．2 木糖生物转化现状

1．3 普鲁兰多糖

1．3．1 普鲁兰多糖分子结构

1．3．2 普鲁兰多糖合成机制

1．3．3 普鲁兰多糖理化性质和用途

1．3．4 普鲁兰多糖国内外生产现状

1．3．5 普鲁兰多糖生产菌种及菌种改造

1．3．6 培养基成分和发酵条件对普鲁兰多糖合成的影响

1．3．7 普鲁兰多糖发酵方式

1．3．8 普鲁兰多糖提取与纯化工艺

1．3．9 普鲁兰多糖的检测方法

1．4 普鲁兰多糖发酵研究

1．4．1 代谢分析

1．4．2 发酵动力学模型

1．5 本课题立题依据及主要研究内容

1．5．1 本课题立题依据

1．5．2 本课题主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验用菌种

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要培养基

2．1．5 溶液的配制

2．2 主要实验方法

2．2．1 多糖产量和残糖量的测定

2．2．2 出发菌株生长曲线的测定

2．2．3 NTG诱变

2．2 ，4出芽短梗霉发酵过程代谢流量计算

2．2．5 发酵动力学模型构建

2．2．6 分析方法

3 结果与讨论

3．1 双波长法同时测定普鲁兰多糖量与残余木糖量方法的建立

3．1．1 普鲁兰多糖与木糖测定双波长的选择

3．1．2 葡萄糖与木糖最适反应时间测定

3．1．3 葡萄糖与木糖检测限实验

3．1．4 葡萄糖、木糖标准工作曲线

3．1．5 方法重复性测定结果

3．1．6 方法的精确度与准确性测定结果

3．1．7 本章小结

3．2 高产普鲁兰多糖菌株诱变选育及氮源优化

3．2．1 出芽短梗霉菌生长曲线

3．2．2 NTG最适浓度的选择

3．2．3 出芽短梗霉菌株致死曲线

3．2．4 突变菌株的筛选

3．2．5 菌株AP-35遗传稳定性实验

3．2．6 不同氮源对多糖产量影响

3．2．7 玉米浆含量优化

3．2．8 硝酸铵含量优化

3．2．9 本章小结

3．3 出芽短梗霉利用木糖发酵生产普鲁兰多糖代谢通量分析

3．3．1 出芽短梗霉利用木糖合成普鲁兰多糖代谢途径

3．3．2 拟稳态取样点确定

3．3．3 出芽短梗霉利用木糖合成普鲁兰多糖代谢流量计算

3．3．4 代谢关键节点选择

3．3．5 关键节点分析

3．3．6 本章小结

3．4 出芽短梗霉发酵动力学模型构建

3．4．1 发酵动力学模型方程的选择

3．4．2 出芽短梗霉菌株发酵过程动力学模型参数估算

3．4．3 拟合曲线分析

3．4．4 拟合曲线发酵验证

3．4．5 本章小结

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士期间发表论文及专利情况

致谢