人工合成荧光蛋白与重组FLAG标签融合蛋白的构建、表达及鉴定

摘要

绿色荧光蛋白(GFP)源于多管水母等海洋无脊椎动物，是一种在生物化学和细胞生物学中得到广泛应用，具有荧光特性的监测细胞或组织内基因表达和蛋白质定位的标记物。但为满足日益提高的技术要求，大量性质优良的荧光蛋白突变体的应用需求变得迫切起来。通过微流体芯片技术与合成生物学方法合成新型荧光蛋白基因，筛选获得5个新型荧光蛋白，对其中一个红色荧光蛋白(H10)和一个绿色荧光蛋白(G2)的性质进行了鉴定。设计多组实验对新型荧光蛋白的在活体菌株的生长速率、荧光蛋白成熟时间、荧光蛋白表达速度、荧光蛋白光谱学性质进行研究，并通过Ni-IDA和FPLC层析两步纯化获得高纯度的荧光蛋白，质谱分析荧光蛋白的分子量。以FLAG标签的原始序列DYKDDDDK
　　 (FLAG4)为模板，设计4种新FLAG标签FLAG1(DYKDYKYK),FLAG2(DYKGGGYK)．FLAG3(DYKDYKDYK)和FLAG5(DYKDEDDK)与G2、H10融合，通过PCR反应分别将以上五种FLAG标签融合到荧光蛋白基因的C端，得到重组表达质粒pET28a-FP-FLAG。在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达重组蛋白，纯化获得高纯度的融合蛋白，Western blotting分析筛选单克隆抗FLAG M2抗体(AFM2)特异性识别的融合蛋白，采用非竞争性ELISA固相法，经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后，得到了FP-FLAG与AFM2的抗原抗体结合反应曲线，计算出FP-FLAG与AFM2的亲和常数。
　　 结果：显示新型荧光蛋白G2,H10分子量分别28.187kD，27.091kD，不仅能够正常的发挥荧光蛋白的生物学功能，且具有成熟速率更快、发光强度更强和发射波长更长的优点。PCR扩增、双酶切及DNA测序鉴定表明重组质粒pET28a-FP-FLAG.构建正确。SDS-PAGE分析显示在30kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带，与预期值相符，该系列重组蛋白以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中。Western blotting分析表明单克隆抗FLAG M2抗体(AFM2)能够特异性识别G2-FLAG4、G2-FLAG5、H10-FLAG3、H10-FLAG4、H10-FLAG5五种FP-FLAG融合蛋白。AFM2与G2-FLAG4、G2-FLAG5的亲和常数分别为1.67E+11、4.65E+10,AFM2与H10-FLAG3、H10-FLAG4、H10-FLAG5的亲和常数分别为6.49E+10、1.47E+11、6.63E+10。结果表明FLAG原始序列FLAG4(DYKDDDDK)与AFM2之间的亲和力最高，FLAG5(DYKDEDDK)与FLAG3(DYKDYKDYK)次之，FLAG1(DYKDYKYK)和FLAG2(DYKGGGYK)最弱。
　　 利用合成生物学和微流体芯片技术合成的新型荧光蛋白，不仅正常的发挥荧光蛋白的生物学功能，且具有成熟速率更快、发光强度更强和发射波长更长的优点。其本身作为一种标记物，与重组FLAG标签融合，形成一个既具有FLAG标签功能又含有荧光蛋白特性的双功能融合蛋白。在FP-FLAG融合蛋白的纯化应用中，运用这些FLAG标签的亲和力差异，在同一纯化体系下通过设计不同的洗提次序和洗提条件，可以达到逐步分离不同目的物的效果。相关工作为筛选适合多肽芯片实验的FLAG标签打下了一定的基础，也为今后FLAG融合蛋白的纯化与检测提供了新的思路和理论基础。