重组FLAG融合蛋白的构建表达及其与AFM2单抗的亲和常数测定

摘要

FLAG融合标签是由八个氨基酸(AspTyrLysAspAspAspAspLys)组成的短肽，专门设计用于重组蛋白的免疫吸附纯化。FLAG标签结构短小，不会对融合蛋白的生物活性产生影响并且可以用一条人工合成的寡核苷酸来编码。FLAG标签可以加在融合蛋白的N端和C端，也能和其他的标签一起使用。而且FLAG标签与融合蛋白之间含有一个肠激酶切割位点，可以通过肠激酶切割被除去。现已发展出了M1、M2和M5三种抗-FLAG单克隆抗体，单抗M1只能特异性的识别位于N末端的FLAG融合蛋白，单抗M5的出现是为了应用于类似N-Met-FLAG-C的序列，显示出对N端Met-FLAG融合蛋白具有更高的亲和力。而M2单抗可以结合到以上提到的所有类型的N末端和C末端FLAG融合蛋白上，因而具有通用性。FLAG融合标签技术已经广泛应用于重组蛋白的免疫吸附纯化工作。
　　 为了得到与抗-FLAG单克隆抗体M2有更高亲合力的FLAG标签，我们以FLAG的原有序列为基础，设计了两个新的FLAG标签，其氨基酸序列分别为DYKDYKDYK和DYKDEDDK。将两个新序列和原有序列分别命名为FLAG1、FLAG2和FLAG3。因为要在NSH2序列的两端加上6His和FLAG标签，每个质粒需要设计两对引物，进行两次PCR。第一次PCR反应的模板是质粒pGEX-2T-NSH2，第二次PCR反应的模板是第一次PCR反应的产物。将第二次PCR反应的产物经Bam.I和Eco.I双酶切后重组到原核表达载体PGEX-2T中，重组表达载体在大肠杆菌中表达融合目的蛋白。利用GST亲和层析柱和分子筛层析柱纯化这些融合蛋白，并用Wester.Blotting检测其免疫活性。免疫印迹结果表明这三个FLAG融合标签都可以被抗-FLAG单克隆抗体M2特异性识别。利用ELISA技术测定三个不同的FLAG标签与抗-FLAG单克隆抗体M2的亲合力。结果显示，三个FLAG融合蛋白和AFM2单克隆抗体都显示了相似的亲和性。通过软件SigmaPlo.10.0分析数据，FLAG1、FLAG2和FLAG3的Kd值分别为0.1438、0.1281和0.080.μM。

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论文说明：缩略语

声明

第一章 文献综述

1.1 融合标签概述

1.1.1 融合标签的分类

1.1.2 融合标签的应用

1.1.3 融合标签的切除

1.2 FLAG融合标签的研究进展

1.2.1 结构特点

1.2.2 FLAG标签的去除

1.3 抗-FLAG单克隆抗体的研究进展

1.3.1 FLAG抗体的种类和使用特点

1.3.2 FLAG抗体的制备

第二章 实验设计

2.1 实验目的和意义

2.2 研究内容

2.3 实验流程图

第三章 融合标签表达载体的构建

3.1 材料与试剂

3.1.1 实验材料

3.1.2 试剂及其配制

3.2 方法和内容

3.2.1 重组表达质粒的构建策略

3.2.2 引物设计

3.2.3 质粒提取

3.2.4 PCR获得目的片段

3.2.5 PCR反应产物的纯化、回收

3.2.6 目的片段和载体的双酶切及纯化回收

3.2.7 连接反应

3.2.8 连接产物的转化

3.2.9 重组克隆的筛选与鉴定

3.3 结果和分析

3.3.1 PCR获得目的片段

3.3.2 重组克隆的PCR和双酶切鉴定

3.3.3 测序结果分析

3.4 小结与讨论

第四章 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

4.1 材料与试剂

4.1.1 实验材料与设备

4.1.2 试剂配制及配制

4.2 方法和内容

4.2.1 重组质粒的诱导表达

4.2.2 重组蛋白表达形式及表达量的检测

4.2.3 GST亲和层析纯化重组蛋白

4.2.4 Sephadex 75 HP(10/50)分子筛柱子进一步纯化

4.3 结果和分析

4.3.1 融合蛋白表达形式确定

4.3.2 重组蛋白的纯化

4.4 小结与讨论

第五章 Western blotting检测免疫活性

5.1 材料和试剂

5.1.1 实验材料及仪器

5.1.2 试剂配制

5.2 方法和内容

5.2.1 蛋白样品的制备

5.2.2 Western blotting

5.3 结果和分析

5.4 小结与讨论

第六章 非竞争性ELISA测定亲和力常数

6.1 材料与试剂

6.1.1 实验材料

6.1.2 试剂配制

6.2 方法和内容

6.3 结果和分析

6.4 小结与讨论

小结

参考文献

致 谢

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