三种FLAG融合标签的构建、表达及亲和常数测定

摘要

FLAG融合标签是由8个氨基酸组成的短肽,可用于重组蛋白的免疫吸附纯化。为了建立一个基于FLAG融合标签的共表达纯化体系,将2个新的FLAG标签序列DYKDYKDYK和DYKDEDDK与FLAG标签的原有序列DYKDDDDK分别命名为FLAG1、FLAG2和FLAG3,利用PCR将FLAG标签融合到SHP2酪氨酸磷酸酶NSH2结构域序列的C端,并将其重组到原核表达载体pGEX-2T中,并在大肠杆菌中进行表达。利用GST亲和层析柱和分子筛层析柱纯化融合蛋白,Western blotting法检测其免疫活性。免疫印迹结果表明,3个FLAG融合标签都可以被抗-FLAG单克隆抗体M2(AFM2)特异性识别。利用ELISA技术测定3个FLAG标签与AFM2的亲和常数(1/Kd),其Kd值分别为0.143 80、.128 1、0.080 1μmol/L。