利用CRISPR/Cas系统构建在XRCC6内源基因插入Flag标签序列的HeLa细胞系

摘要

目的:利用CRISPR/Cas系统在XRCC6基因5'端插入Flag标签序列,筛选XRCC6-Flag稳定表达的宫颈癌细胞(HeLa)株.方法:根据GenBank中XRCC6基因序列,设计XRCC6基因敲入的gRNA序列,构建入pCas-Guide载体中,获得pCas-XRCC6载体;设计XRCC6基因的同源臂序列,利用搭桥PCR方法将同源臂和Flag标签序列作为模板进行扩增,得到供体DNA片段,并将其克隆到pBackZero-T表达载体上,获得pXRCC6-Donor载体;将上述2个载体共转染HeLa细胞,采用PCR、Western印迹等方法检测和筛选Flag标签序列插入XRCC6基因5 '端的细胞株.结果:构建了pCas-XRCC6和pXRCC6-Donor载体,筛选获得3株XRCC6-Flag稳定表达细胞株.结论:构建了XRCC6-Flag稳定细胞株,为研究XRCC6基因及其蛋白产物的生物学功能奠定了基础.