利用CRISPR-Cas9系统构建的敲除IFN-β基因的293T细胞系

摘要

本发明公开了利用CRISPR-Cas9系统构建的敲除IFN-β基因的293T细胞系。本发明所提供的敲除IFN-β基因的293T细胞系，具体为人胚肾细胞293T-KO-IFN-β，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？No.10096。实验证明，本发明所得的敲除IFN-β基因的293T细胞系不能正确的表达IFN-β蛋白。由于IFN-β蛋白具有抗病毒作用，故B型流感病毒在野生型的293T细胞中不能大量的增殖。而敲除IFN-β基因的293T细胞系由于不能正确的表达IFN-β蛋白，故可用于B型流感病毒在该细胞系中更好的增殖，获得更大量病毒用于实验研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用CRISPR-Cas9系统构建的敲除IFN-β基 因的293T细胞系。

背景技术

293T细胞由293细胞衍生而出，293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞 系，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。 用Ca₃(PO₄)₂转染效率可高达50％。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析 可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细 胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式。

IFN-β是在细菌、病毒、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(Poly IC)、核苷酸等刺激物诱导 下，主要由成纤维细胞、白细胞等产生的一种糖蛋白。HuIFN-β的基因均定位于人第 9号染色体，HuIFN-β蛋白由166个氨基酸组成，属于糖基化蛋白，分子量约23KD， 肽链中含3个Cys，分别在17、31和141位，其中31和141位的半胱氨酸之间形成 的二硫键对HuIFN-β的生物学活性非常重要。IFN-β具有多种生物学功能，主要包括 抗病毒、抑制某些细胞的生长、免疫调节及抑制和杀伤肿瘤细胞的功能。IFN-β的抗 病毒效果针对不同的病毒，甚至是同一病毒的不同血清型而不同。其抗病毒的作用机 理主要是通过两个方面实现：1)通过抑制某些病毒的吸附、脱衣壳和转录、病毒蛋白 合成以及成熟病毒的释放来实现其抗病毒功能；2)通过增强自然杀伤NK细胞，单 核巨噬细胞对病毒的吞噬作用来实现其抗病毒功能。IFN-β还可以抑制某些细胞的生 长，如成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞以及造血细胞的增殖，其机理可能是通过使 细胞分裂停留在G0/G1期,降低DNA的合成，下调细胞原癌基因的转录水平，下调 某些生长因子受体表达。IFN-β还具有免疫调节作用，包括促进大多数细胞MHC-I类 抗原的表达，活化NK细胞和杀伤性T淋巴细胞增强巨噬细胞的功能，调节T、B淋 巴细胞的功能。IFN-β可抑制和杀伤肿瘤细胞，主要是通过促进机体的免疫功能，提 高巨噬细胞、NK细胞和CT L的杀伤水平。

CRISPR-Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代 基因组编辑技术，该技术来源于细菌和古细菌中存在抵抗噬菌体入侵的CRISPR-Cas 获得性免疫系统，经人工改造而逐渐发展起来。CRISPR是指规律成簇间隔短回文重 复序列，Cas是指CRISPR相关蛋白。CRISPR-Cas基因组编辑技术是通过一段RNA 来识别打靶位点，通过Cas核酸内切酶对打靶位点附近的核酸进行切割来实现对基因 组的定点编辑，因此该技术也叫做RNA指导的核酸内切酶技术。与ZFN和TALEN 技术相比，CRISPR-Cas基因组编辑技术在设计、合成与阳性克隆的筛选上都更为便捷， 而且可以实现同时在一个细胞内对多个位点进行编辑，提高基因编辑的效率。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种敲除IFN-β基因的293T细胞系。

本发明所提供的敲除IFN-β基因的293T细胞系具体为人胚肾细胞 293T-KO-IFN-β，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC No.10096。

本发明的第二个目的是提供一种基于CRISPR-Cas9构建敲除IFN-β基因的293T 细胞系的方法。

本发明所提供的基于CRISPR-Cas9构建敲除IFN-β基因的293T细胞系的方法， 是以序列表中序列1所示IFN-β基因序列中符合5’-GG-18N-NGG-3’或 5’-GG-20N-NGG-3’或5’-CCN-18N-CC-3’或5’-CCN-20N-CC-3’序列排列规则的序列 中的“18N”或“20N”所示序列为靶序列的；N为A或T或C或G。其中，18N为 18个脱氧核糖核苷酸，20N为20个脱氧核糖核苷酸.

所述靶序列可为1-2个；当所述靶序列为2个时，2个所述靶序列之间的间隔优 选为大于200bp。

在本发明的一个实施例中，所述靶序列为序列表中序列1所示IFN-β基因序列的 第216-235位，(记为靶序列1)；在本发明的另一个实施例中，所述靶序列为序列表 中序列1所示IFN-β基因序列的第545-562位(记为靶序列2)。

更加具体的，所述方法为如下(A)或(B)：

(A)包括如下步骤(a1)-(a4)：

(a1)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA； 所述正向单链DNA1的序列如序列表中序列2所示，为在所述靶序列1的5’端加上 ACCG；所述反向单链DNA1的序列如序列表中序列3所示，为在所述靶序列1的反 向互补序列的5’端加上AAAC；

(a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链 DNA1(特异于靶序列1)，该双链具有粘末端，其粘末端与BsaI酶切后的pGL-U6-gRNA 质粒的酶切位点互补，可直接进行连接反应；

(a3)将所述双链DNA1连接到pGL-U6-gRNA质粒的限制性内切酶BsaI的切割 位点处，得到的重组质粒记为pGL-U6-gRNA-IFNβ-1；

(a4)将所述pGL-U6-gRNA-IFNβ-1(Puromycin抗性)和Cas9质粒(Blasticidin 抗性)，共转染293T细胞，用Puromycin(3ug/ml)和Blasticidin(3ug/ml)进行抗性 筛选，筛选时间为7天，然后换为正常的DMEM培养基，从转染后的293T细胞中获 得IFN-β基因被敲除的293T细胞系；

(B)包括如下步骤(b1)-(b4)：

(b1)合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA； 所述正向单链DNA2的序列如序列表中序列4所示，为在所述靶序列2的反向互补序 列的5’端加上ACCG；所述反向单链DNA2的序列如序列表中序列5所示，为在所述 靶序列2的5’端加上AAAC；

(b2)将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链 DNA2(特异于靶序列2)，该双链具有粘末端，其粘末端与BsaI酶切后的pGL-U6-gRNA 质粒的酶切位点互补，可直接进行连接反应；

(b3)将所述双链DNA2连接到pGL-U6-gRNA质粒的限制性内切酶BsaI的切割 位点处，得到的重组质粒记为pGL-U6-gRNA-IFNβ-2；

(b4)将所述pGL-U6-gRNA-IFNβ-2(Puromycin抗性)和Cas9质粒(Blasticidin 抗性)，共转染293T细胞，用Puromycin(3μg/ml)和Blasticidin(3μg/ml)进行抗性 筛选，筛选时间为7天，然后换为正常的DMEM培养基，从转染后的293T细胞中获 得IFN-β基因被敲除的293T细胞系；

在所述方法的步骤(a2)和(b2)中，所述退火反应的条件均可为：97℃作用7min， 然后关机，自然降温1h。

在所述方法的步骤(a4)和(b4)中，将所述pGL-U6-gRNA-IFNβ-1(或所述 pGL-U6-gRNA-IFNβ-2)和Cas9质粒共转染293T细胞时，所述pGL-U6-gRNA-IFNβ-1 (或所述pGL-U6-gRNA-IFNβ-2)和所述Cas9质粒的质量比可为1:1。

利用所述方法制备得到的IFN-β基因被敲除的293T细胞系也属于本发明的保护 范围。

所述IFN-β基因被敲除的293T细胞系具体为所述人胚肾细胞 293T-KO-IFN-βCGMCC No.10096。

本发明的第三个目的是提供一种成套质粒。

本发明所提供的成套质粒由所述pGL-U6-gRNA-IFNβ-1(或所述 pGL-U6-gRNA-IFNβ-2)和所述Cas9质粒组成。

其中，所述成套质粒中的两种质粒可以分别单独包装，也可以按照质量比为1:1 的比例混合包装。

所述成套质粒的用途也属于本发明的保护范围。

所述用途具体为基于CRISPR-Cas9敲除293T细胞中IFN-β基因(序列1)。

本发明的第四个目的是提供一种基于CRISPR-Cas9构建敲除IFN-β基因的293T 细胞系的试剂盒。

本发明所提供的基于CRISPR-Cas9构建敲除IFN-β基因的293T细胞系的试剂盒， 含有所述成套质粒及说明书；所述说明书中记载有如上所述的基于CRISPR-Cas9构建 敲除IFN-β基因的293T细胞系的方法。

所述人胚肾细胞293T-KO-IFN-β，或利用所述方法制备得到的IFN-β基因被敲除 的293T细胞系在扩增B型流感病毒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的优点在于：敲除IFN-β基因的293T细胞系，或缺少IFN-β基因的一部 分，或由于敲除或插入某些片段而引起移码突变，故不能正确的表达IFN-β蛋白。由 于IFN-β蛋白具有抗病毒作用，故B型流感病毒在野生型的293T细胞中不能大量的 增殖。而敲除IFN-β基因的293T细胞系由于不能正确的表达IFN-β蛋白，故可用于B 型流感病毒在该细胞系中更好的增殖，获得更大量病毒用于实验研究。

保藏说明

参椐的生物材料：293T-KO-IFN-β

科学描述：人胚肾细胞

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2014年12月1日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10096

附图说明

图1为PCR鉴定结果。

图2为Westren-Blotting鉴定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pGL-U6-gRNA质粒：将gRNA人工插入该质粒后组成的重组质粒具有导向作用， 可以与所要编辑的基因组中相应的位置进行结合，起到Guiding的作用。记载于“Ma  Y,Ma J,Zhang X,Chen W,Yu L,Lu Y,Bai L,Shen B,Huang X,Zhang L.2014. Generation of eGFP and Cre knockin rats by CRISPR/Cas9.FEBS J.Jul 17.doi: 10.1111/febs.12935.”一文，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

Cas9质粒：具有核酸内切酶的功能，该Cas9质粒可以通过与pGL-U6-gRNA的 结合后到达所要编辑的基因组的位置实现其对基因组的切割功能。记载于“Ma Y, Zhang X,Shen B,Lu Y,Chen W,Ma J,Bai L,Huang X,Zhang L.2014.Generating rats  with conditional alleles using CRISPR/Cas9.Cell Res.Jan；24(1):122-5.”一文，公众可从 中国科学院微生物研究所获得。

pGL-U6-gRNA质粒和Cas9质粒上都带有药物抗性，通过药物筛选，可获得基因 敲除的细胞系。

大肠杆菌TOP10：购自Invitrogen公司和货号C4040-10。

293T细胞：记载于“Sh Cao,X-L Liu,M-R Yu,J Li,X-J Jia,Y-H Bi,L Sun,George F. Gao,W-J Liu*.2012.A Nuclear Export Signal in the Matrix Protein of Influenza A Virus Is  Required for the Efficient Virus Replication.Journal of Virology,86(9):4883-91。”一文，公 众可从中国科学院微生物研究所获得。

实施例1、敲除IFN-β基因的293T细胞系的构建

一、待敲除基因靶序列的确定及DNA oligo引物的设计

1、待敲除基因靶序列的确定

以HuIFN-β基因序列(序列1，无内含子)为待敲除基因，利用DNAStar软件中 的Editseq软件对HuIFN-β基因序列进行分析，在此基础上人工筛选合适的靶序列。 对于HuIFN-β基因全序列本发明的发明人最终设计了两个靶序列，分别为序列表中序 列1的第216-235位(GAGGCTTGAATACTGCCTCA，记为靶序列1)和序列1的第 545-562位(AGGAGTACAGTCACTGTG，记为靶序列2)。

在进行靶序列确定时，本发明的发明人是按照如下原则进行的：

(1)优先选择HuIFN-β基因全序列(序列1)中符合5’-GG-18N-NGG-3’(N代 表A或T或C或G)或5’-GG-20N-NGG-3’序列排列规律的序列中的“18N”或“20N” 所示序列作为靶序列。若所要敲除的基因的全序列中没有上述两种序列，也可选择上 述两种序列的互补序列5’-CCN-18N-CC-3’或5’-CCN-20N-CC-3’基序，将其方向互补 后使用。

(2)一般选择外显子上的符合(1)中要求的序列为靶序列，一般同一个敲除的 细胞系同时设立两对符合要求的靶序列。

(3)选择两对符合要求的靶序列时两者最好要间隔一定的距离(>200bp)。

(4)所选择的靶序列最好位于所翻译的蛋白质的较重要的功能结构域，这样能更 好的保证敲除效果。

2、DNA oligo引物的设计

根据步骤1确定的靶序列，设计两对DNA oligo引物，具体序列如下：

合成了两对寡核苷酸引物用于制备gRNA，序列如下：

针对靶序列1的DNA oligo引物：

HuIFNβ-gRNA-UP1：5’-ACCGGAGGCTTGAATACTGCCTCA-3’(序列2)；

HuIFNβ-gRNA-DOWN1：5’-AAACTGAGGCAGTATTCAAGCCTC-3’(序列3)。

针对靶序列2的DNA oligo引物：

HuIFNβ-gRNA-UP2：5’-ACCGCACAGTGACTGTACTCCT-3’(序列4)；

HuIFNβ-gRNA-DOWN2：5’-AAACAGGAGTACAGTCACTGTG-3’(序列5)。

二、表达gRNA的重组质粒的构建

1、寡核苷酸单链退火获得双链寡核苷酸

将合成的针对靶序列1的两条DNA oligo单链(序列2和序列3)退火，得到双 链双链寡核苷酸1。

将合成的针对靶序列2的两条DNA oligo单链(序列4和序列5)退火，得到双 链双链寡核苷酸2。

退火反应体系及退火反应条件均如下：

退火反应体系：HuIFNβ-gRNA-UP1或HuIFNβ-gRNA-UP2(浓度10mM)20μl； HuIFNβ-gRNA-DOWN1或HuIFNβ-gRNA-DOWN 2(浓度10mM)20μl；NEB buffer2 10μl。

退火反应条件：将上述体系混合均匀后PCR仪中，97℃作用7min，然后关机， 自然降温，1h后取出样品进行2％的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收退火产物，所用 回收试剂盒为寡核苷酸回收试剂盒(天根公司)，具体操作步骤严格按其说明书进行。

2、酶切及连接反应

用去内毒素的质粒提取试剂盒提取pGL-U6-gRNA质粒，然后用限制性核酸内切 酶BSAI进行酶切，酶切条件为37℃切4h。将酶切后的质粒进行1％的琼脂糖凝胶电 泳检测酶切效果并进行胶回收，胶回收所用试剂盒为博迈德公司产品。

因退火产物直接含有与pGL-U6-gRNA载体酶切位点互补的粘末端，故可以直接 用于连接实验。

将胶回收后的酶切质粒与胶回收退火产物进行连接反应，具体体系及条件如下：

连接体系：胶回收后的退火产物(双链寡核苷酸1或双链寡核苷酸2)6μl；胶 回收后的酶切pGL-U6-gRNA载体2μl；连接酶1μl；10×连接酶Buffer 1μl。

连接条件：PCR仪中16℃连接过夜。

3、转化

于超净工作台中将10μl连接产物加入50μl的大肠杆菌TOP10感受态细胞中，冰 浴30min，然后42℃水浴中热激90sec，接着冰浴5min，然后加入500μl无抗LB液体 培养基后，37℃，200rpm震荡培养40min后，涂布氨苄抗性的LB固体平板，37℃培 养箱中培养过夜。待出现单菌落后，挑取5个大小适中的菌落，提取质粒，交由博迈 德公司进行测序。

将经测序表明在pGL-U6-gRNA质粒的酶切位点BSAI处插入

“5’-GAGGCTTGAATACTGCCTCA-3’”所示DNA片段的重组质粒命名为

pGL-U6-gRNA-IFNβ1；将经测序表明在pGL-U6-gRNA质粒的酶切位点BSAI处插入

“5’-CACAGTGACTGTACTCCT-3’”所示DNA片段的重组质粒命名为

pGL-U6-gRNA-IFNβ2。

4、重组质粒的提取

将测序正确的克隆进行扩大培养，用去内毒素的质粒提取试剂盒(天根公司)提 取重组质粒并测定质粒浓度，重组质粒的具体操作步骤严格按照说明书进行。

三、转染及单克隆的筛选

将步骤二构建的重组质粒pGL-U6-gRNA-IFNβ1(或pGL-U6-gRNA-IFNβ2)与Cas9 质粒共转293T细胞，具体操作步骤如下：

(1)将293T细胞分至10cm细胞培养皿后培养过夜，所用培养基为含10％(体 积分数)FBS的DMEM培养基，待次日早细胞汇合度达到70％左右时进行下步操作。

(2)将细胞汇合度达到70％的细胞换液至opti-MEM中，2h后进行转染。然后 将两种质粒及Lip2000分别稀释至250μl的opti-MEM中，然后将稀释后的Lip2000加 入稀释后的混合质粒中，轻轻混匀，静置20min后，轻轻滴加提前换至opti-MEM培 养基的细胞中，置于37℃细胞培养箱中进行培养，4-6h后将细胞换液至含10％(体积 分数)FBS的DMEM培养基中继续培养。所转染的两种质粒浓度为分别12μg/10cm 皿，质粒与Lip的比例为1：2.5，即加24μg的混合质粒，则需要使用的Lip2000的量 为60μl。

(3)待加完质粒24h后，将细胞换液至含3μg嘌呤霉素和3μg杀稻瘟菌素的10％ (体积分数)FBS的DMEM培养基中，培养3-5天，每个24h换一次新鲜的抗性培养 基。

(4)待3-5天出现单克隆后，换为抗性减半的培养基维持2-3天，之后换为不加 抗性含10％(体积分数)FBS的DMEM的培养基进行培养。

(5)待细胞形成单克隆后，有限稀释法将细胞稀释至96孔板中，培养7天后挑 取单克隆孔，传代至24孔板中进行扩大培养。24孔板中培养4-5天后，胰酶消化传 代至12孔板中，每个单克隆传2个孔，一个孔用于扩大培养至6孔板以方便后续的 PCR检测，一个孔用于留存。

(6)PCR鉴定阳性克隆

将扩大至6孔板的单克隆进行细胞基因组DNA的提取，所用试剂盒为天根公司 生产。

用于PCR鉴定共转染了重组质粒pGL-U6-gRNA-IFNβ1与Cas9质粒的293T细胞 的引物序列如下：

PCR-KOIFN-β-up1：5’-TCTAACTGCAACCTTTCGAAGCC-3’(序列1的第5-27 位)；

PCR-KOIFN-β-down1：5’-CCAGGACTGTCTTCAGATGGTTT-3’(序列1的第 423-445位的反向互补序列)。

采用PCR-KOIFN-β-up1/PCR-KOIFN-β-down1引物对扩增得不到大小为441bp目 的条带(序列1的第5-445位)的克隆为阳性。

用于PCR鉴定共转染了重组质粒pGL-U6-gRNA-IFNβ2与Cas9质粒的293T细胞 的引物序列如下：

PCR-KOIFN-β-up2：5’-GCATTGACCATCTATGAGATGCT-3’(序列1的第304-326 位)；

PCR-KOIFN-β-down2：5’-CTTCTAGTGTCCTTTCATATGCAG-3’(序列1的第 731-754位的反向互补序列)。

采用PCR-KOIFN-β-up2/PCR-KOIFN-β-down2引物对扩增得不到大小为451bp目 的条带(序列1的第304-754位)的克隆为阳性。

实验同时以野生型的293T细胞系基因组为模版作为对照组。

结果显示，以野生型293T细胞系基因组为模版的对照组，采用PCR-KOIFN-β-up1/ PCR-KOIFN-β-down1引物对扩增得得到了大小为441bp目的条带(序列1的第5-445 位)，采用PCR-KOIFN-β-up2/PCR-KOIFN-β-down2引物对扩增得了大小为451bp目的 条带(序列1的第304-754位)。而共转染了重组质粒pGL-U6-gRNA-IFNβ1与Cas9 质粒的293T细胞，以及共转染了重组质粒pGL-U6-gRNA-IFNβ2与Cas9质粒的293T 细胞均获得了阳性克隆。其中，部分采用PCR-KOIFN-β-up1/PCR-KOIFN-β-down1引 物对鉴定共转染了重组质粒pGL-U6-gRNA-IFNβ1与Cas9质粒的293T细胞阳性克隆 的结果如图1所示，泳道1为以野生型293T细胞系基因组为模版的对照组；泳道2 为敲除了部分HuIFN-β基因后的293T细胞系的阳性克隆(即本发明最终获得的保藏 细胞293T-KO-IFN-β)的扩增结果。

(7)Western-blot鉴定IFN-β的表达情况

①将所要鉴定的细胞系和野生型的293T细胞传代至24孔板中，培养过夜，所 用培养基为含10％(体积分数)FBS的DMEM培养基，待次日早细胞汇合度达到70％ 左右时进行下步操作。

②用A型流感病毒的PR8株(A/H1N1/PR8)(记载于“钟菊迎,崔晓兰,时宇静 等.金柴抗病毒胶囊防治甲型H1N1流感病毒PR8株感染小鼠肺炎的实验研究.世界 中西医结合杂志,2010年第5卷第4期”一文)感染所要检测的细胞系，感染剂量为 MOI＝0.1，感染前和感染后12h分别取样。将细胞沉淀中加入预冷的Lysis buffer(配 方：1％体积分数的Triton X100，150mM的NaCl，20mM的Hepes，10％体积分数的 甘油，1mM的EDTA，pH7.4)，每孔100μl，用细胞刮刮下细胞后，置入1.5ml的EP 管中，离心后弃细胞沉淀，上清备用。

③将准备好的样品进行Western-blot分析。具体操作步骤为：

A.按照《分子克隆》所述的方法进行SDS-PAGE。用预染的蛋白质分子量Marker。 电泳完毕后，将凝胶放入电转缓冲液中平衡2min后进行转膜。

B.按照凝胶的大小剪好六张3mm厚滤纸，浸泡于转移缓冲液中。剪一张比滤纸 稍大的PVDF膜，在甲醇浸泡5min以上，电转液平衡10min后使用。在半干转膜仪 中依次放置3层厚滤纸、转印膜、凝胶、3层滤纸，注意赶走各层间气泡。15V电转 20min。

C.切勿使转移的转印膜变干，转膜结束后快速放于适量封闭液中封闭。室温轻摇 1h。

D.将转印膜放入杂交袋内，按照0.1ml/cm²用量分别加入用封闭液适当稀释的鼠 抗HuIFNβ一抗(Santa Cruz公司产品，目录号：sc-17565，1:1000稀释)，除尽气泡， 封口。在室温下置于脱色摇床上轻摇孵育2h左右(或于4℃轻摇过夜)，使抗体充分 结合。将膜去除后放入TBST溶液中，洗膜3次，每次7min。

E.将膜放入杂交袋内，加入用封闭液配制的辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应 羊抗鼠IgG二抗(Santa Cruz公司产品，目录号：sc-166261，1:5000稀释)。赶除气泡 封口，室温振荡2h。

F.取出转印膜，用TBST洗三次，每次10min。

G.取发光液(天根公司产品)A液、B液各0.5ml等体积混合均匀。将转印膜轻 轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上放在保鲜膜上。将ECL混合液滴加到转印 膜上，反应3min。立即用保鲜膜包裹PVDF膜，注意表面要平整，放入CLINX化学 凝胶成像仪中成像。

结果如图2所示，泳道1为以敲除部分HuIFN-β基因后的293T细胞系感染前0h 的结果(无目的条带)，泳道2为以敲除部分HuIFN-β基因后的293T细胞系感染后12h 的结果(无目的条带)，泳道3为野生型的293T细胞系感染前0h的结果(无目的条 带)，泳道4为野生型的293T细胞系感染后12h的结果(得到大小约为21KD的目的 条带，与预期大小一致)。从结果可以看出，敲除部分HuIFN-β基因后的293T细胞系 (即本发明最终获得的保藏细胞293T-KO-IFN-β)在病毒刺激后12h仍然检测不到 HuIFN-β蛋白的表达，表明该细胞系敲除成功。

本发明的发明人将其中一个经以上PCR鉴定和Western-blot鉴定均为阳性的克隆 (共转染了重组质粒pGL-U6-gRNA-IFNβ1与Cas9质粒的293T细胞)于2014年12 月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，参椐的生物材料：293T-KO-IFN-β，科学描 述：人胚肾细胞，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10096。