桦褐孔菌子实体和发酵多糖的促生细胞因子作用及化学结构研究

摘要

桦褐孔菌（Inonotus obliquus），又名“白桦茸”，欧洲人喜欢叫它“Chaga”。它属于担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、刺革菌科，是来自西伯利亚原始森林中的一种神秘药用真菌。桦褐孔菌寄生于桦树上，是极其耐寒的菌种，能在零下69℃的环境下生长，生长期达15年。野生的桦褐孔菌成年菌会吸干桦树的精华，导致树木干枯，故而其自然资源十分稀缺，其价格在国际市场上远胜于珍贵药用真菌桑黄。因此，人工培养桦褐孔菌子实体或菌丝体非常必要，运用液体深层发酵生产桦褐孔菌菌丝体是一条有效的途径，这为研究和开发桦褐孔菌提供了充足的原材料。近年来，人们不断加大对桦褐孔菌液体培养和菌丝体基础培养方面的研究广度和深度，以求能缩短生长周期和增进其产量。同时，随着对药用真菌多糖等活性物质的深入研究，多糖作为桦褐孔菌主要成分，其营养价值和药用价值逐渐引起人们的关注，成为医药工业和保健品工业的热门开发领域。
　　 本论文主要对从野生桦褐孔菌子实体和优化后的液体深层发酵培养基的发酵液和菌丝体中分别提取分离获得的胞外、胞内多糖进行化学结构和生物学免疫活性的研究。测定和比较各不同来源的粗多糖、除蛋白多糖以及经过DEAE-52阴离子交换色谱和Sephadex G-200凝胶渗透色谱柱层析分离纯化的多糖组分的总含糖量和蛋白含量。通过测试其对人外周血单个核细胞分泌细胞因子TNF-α、1FN-γ、1L-1β和1L-2的调节作用，分析各多糖提取物及组分的免疫活性。利用气相色谱法(GC)分析单糖（结构单元）组成，红外光谱(IR)和核磁共振(NMR)法分析各多糖糖苷键和异头碳的构型。
　　 实验结果表明:
　　 1)从响应面优化培养基液体深层发酵的发酵液中获得的胞外粗多糖(EPS)、菌丝体热水浸提获得的胞内粗多糖(IPS)的总含糖量均比桦褐孔菌子实体粗多糖(FSPS)的高，EPS和IPS蛋白含量远远低于FSPS。上述三种多糖除蛋白后多糖提取物各记为DEPS、DIPS、DFSPS，糖含量以DIPS的最高，达到了80.9％。脱蛋白多糖经DEAE-52柱层析分离后的组分分别为DEPS1、DEPS2、DEPS3、DEPS4，DIPS1、DIPS2、DIPS3和DFSPS1，其中组分DIPS1组分的糖含量是所有组分中最高的，为86.1％。子实体提取处理得到的各多糖样品蛋白含量都在20％以上;
　　 2)经DEAE-52分离的各组分分别过Sephadex G-200柱，进一步分离纯化得到各自单一洗脱峰，峰型对称性好，可以认为得到的是纯组分，对应记作PDEPS1、PDEPS2、PDEPS3、PDEPS4, PDIPS1、PDIPS2、PDIPS3和PDFSPS1;
　　 3)所有的多糖样品均表现出增进细胞分泌细胞因子的作用，并且随着浓度的增大，这种促生作用加强。对于粗糖提取物，发酵胞外多糖、胞内多糖、子实体多糖及各除蛋白多糖在各浓度下对TNF-α、IFN-γ、1L-1β和1L-2四种细胞因子的促生效果不是完全一致，但是各种多糖的促生活性几乎无差异;
　　 4)柱层析分离纯化后的多糖组分的细胞因子实验表明，在较低浓度下PDEPS、PDIPS和PDFSPS的组分对细胞因子调节作用几乎无差异，但是在浓度为150μg/mL时，纯化组分之间的活性差异性变大，而且此高浓度下活性最低的大多是来自子实体多糖的PDFSPS1;
　　 5)单糖组分的分析结果表明，子实体多糖单糖组成以葡萄糖占比例最高，其次是甘露糖、半乳糖和木糖。发酵产胞外多糖组成是半乳糖含量最高，而胞内多糖的各单糖所占比例相对均匀;
　　 6) IR和NMR法对纯化多糖进行结构表征，由IR图谱可知多糖结构很相似，都在3400cm-1处有强的宽峰，为O-H伸缩振动吸收峰，在3000-2800cm-1处均有尖峰，为C-H的伸缩振动吸收峰，在1200-1000cm-1处均有C-O（包括C-O-H和糖环的C-O-C）的伸缩振动吸收峰，这些是多糖经典吸收峰，是判断物质是否为糖类的根本。所有多糖在1650-1550cm-1处均有N-H变角振动所形成的吸收峰，说明多糖样品中含有蛋白成分，即所有纯化样品是糖与蛋白的复合物。所有组分在930～960cm-1区域都有吸收峰，说明桦褐孔菌多糖以吡喃糖为主。870cm-1或810cm-1附近都有吸收峰，说明其都含有甘露糖组分，这与气相测得的数据一致;
　　 7)体积排阻与激光光散色法联用(size exclusion chromatography with laser light scattering，SEC-LLS)测多糖的分子量，EPS组分分子量在28～58kDa，IPS的分子量在89～120kDa，FSPS组分1重均分子量为32kDa，可见，发酵多糖的分子量是比较大的，尤其是菌丝体多糖，其组分分子量都很高;
　　 从以上结果我们得出，桦褐孔菌发酵产物多糖和桦褐孔菌子实体多糖在促进细胞因子分泌上的效果是差不多的，且在同浓度下，发酵多糖的活性稍微更强，由此说明液体深层发酵桦褐孔菌多糖有很好的免疫调节作用，这为桦褐孔菌的扩大培养和桦褐孔菌多糖作为药物在临床上的开发应用提供了依据。