杆状病毒介导以Dll4蛋白为靶点的癌症疫苗的研究

摘要

Dll4蛋白是VEGF的一个配体，在血管生成过程中起到关键作用。据研究，在许多肿瘤中如乳腺癌，胃癌等都存在Dll4蛋白过表达现象。在肿瘤生长过程中当封闭Dll4通路时，使得血管内皮细胞侧向生长不受抑制，从而导致肿瘤因血管分支过多，生成无功能的血管，无法正常输送氧气和营养物。课题利用杆状病毒作为载体诱导体内产生针对Dll4的抗体，从而封闭Dll4通路，达到抑制肿瘤生长的目的。
　　 通过将人源Dll4基因用重叠PCR方法将其与家蚕杆状病毒信封蛋白gp64的信号肽序列和跨膜区序列连接，并插入到pFastBacl载体对克隆位点BamH1和Xholl两个酶切位点之间。利用Bac-to-Bac系统，将其构建成表面展示Dll4蛋白的杆状病毒。将构建好的载体pFastBacl-Dll4转化大肠杆菌DH10Bac，进行蓝白斑筛选。挑选白斑培养，提取Bacmid，用脂质体转染BmNcell。转染六天后，可见细胞明显发病，提取病毒基因组鉴定。再转接病毒于已长满细胞的大细胞培养瓶中，三天后，12000rpm离心30min，收集发病细胞和细胞液上清，将病毒上清液50000rpm超速离心45min，用PBS重悬沉淀．在30％和60％的蔗糖中进行梯度密度离心，收集目的区带，脱糖后，取少量制样，进行WesternBloting鉴定。将脱糖后获得的病毒进行蛋白定量后，以每份100μg粗蛋白注射免疫C57BL/6小鼠。每隔七天进行一次免疫，连续免疫3次，第三次免疫后第二天给免疫后的小鼠接种小鼠Lewis肺癌细胞。每隔一日检查并记录肿瘤生长情况。接瘤12天后，对实验小鼠眼眶取血，并拉颈处死，剥取瘤体，测量体积。将所取的血清用ELISA检测Dll4抗体效价。经检测，在10μg/mL抗原包被的情况下疫苗组小鼠血清中Dll4效价为1∶3200。与对照组比较，疫苗免疫组的肿瘤体积约为对照组的50％。
　　 BmCMV-Dll4-VSVG,BmCMV-Dll4-DAF,BmCMV-EGFP-VSV,BmCMV-EGFP-DAF的构建方法与Bmgp64Dll4相同，将构建的BmCMV-Dll4-VSVG，BmCMV-EGFP-DAF两个病毒在体外转导哺乳动物细胞Hek293T，均能够在细胞中表达目的蛋白。其中利用BmCMV-EGFP-DAF病毒以不同的感染复数转导293T细胞，证明杆状病毒的转导效率与感染复数成正比，当感染指数达到100MOI以上时也能够产生较好的转导效果。