侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子方法

摘要

本发明公开了侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子方法，其按下列步骤进行：(1)构建DAP营养缺陷型菌株E.coli ΔASD DH10B；(2)将Bacmid和转座辅助质粒以及表达侵染蛋白助手质粒电转化进E.coli ΔASD DH10B，构建新的受体菌ΔASD DH10Bac/PGB2Ωinv；(3)引入外源基因获得重组ΔASD DH10Bac/ PGB2Ωinv；(4)重组 ΔASD DH10Bac/ PGB2Ωinv直接感染与杆状病毒对应的昆虫细胞获得重组杆状病毒粒子。本发明避免了传统方法中DNA转染昆虫细胞的局限性，做到真正经济、快速、高效，有利于杆状病毒表达系统的广泛利用。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体是一种侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子的方法。

背景技术

因具有对人及哺乳动物安全、超强的多角体启动子(p^polh)驱动外源基因在昆虫细胞内高效表达、昆虫细胞培养方便、病毒操作简单、克隆外源片段能力大(30-50kb)、表达产物具有正确后加工等特点，杆状病毒表达系统(BES，Baculovirus Expresson System)已经成为表达真核生物基因的优秀表达系统之一。目前，利用杆状病毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等。目前主要使用两种杆状病毒表达系统，一种为商业化的AcNPV-sf9或者AcNPV-High5系统，该系统利用重组AcNPV在离体培养细胞sf9或者High5中进行外源基因表达。另外一种就是BmNPV-家蚕幼虫表达系统，该系统利用重组BmNPV在家蚕活体内进行蛋白表达。家蚕饲养在我国具悠久的历史，其培养方式简单，成本较低，其成本为细胞培养的1/10，而蛋白表达量则为培养细胞的10倍左右，因此杆状病毒—家蚕表达系统在经济高效大量表达外源蛋白方面具有极为诱人的前景和优势。

无论何种重组杆状病毒，最后都必须通过将提取的重组病毒DNA转染昆虫细胞产生杆状病毒粒子，以达到蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等应用。目前将DNA载体(包括Bacmid DNA)转染进昆虫宿主细胞的方法有脂质体(lipofectin)介导的转染法，磷酸钙—DNA共沉淀法和显微注射法。其中磷酸钙—DNA共沉淀法成本最低，对DNA质量要求非常高，而且对操作以及PH值要求严格，PH值微小的改变就可导致转染效率急剧下降，因此总体转染效率不高，重复性较差，转染效果不稳定。脂质体(lipfectin)介导的转染方法简单，且转化常规小质粒效率较高(40-80％)，而转染100kb以上的大质粒的效率相对较低(5—10％)。但是脂质体价格极其昂贵，实验成本太高，和磷酸钙转染一样，依然需要提取和精制高质量DNA，再与脂质体进行混合，转染过程比较复杂耗时。显微注射法操作过程烦琐，需要价值上百万的显微操作系统支持，成本极高，和操作者的经验密切相关，主要用于单细胞注射试验，普通实验室根本不可能使用。无论是磷酸钙还是脂质体转染法，都需要制备高纯度的DNA和试剂按一定的比例进行混合，让DNA与脂质体或者磷酸钙形成复合体，再经过复杂的转染操作过程才能转染进细胞。因此现有的这几种DNA进入昆虫宿主细胞的转染方法都有其局限性，限制了杆状病毒表达系统的广泛利用。

发明内容：

为解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种避免复杂昂贵的昆虫细胞转染过程，从而经济、快速、高效侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子的方法。

为实现上述发明目的，本发明所述的侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子的方法按下述步骤实现：(1)构建DAP营养缺陷型菌株E.coliΔASD DH10B；(2)将Bacmid和转座辅助质粒以及表达侵染蛋白助手质粒电转化进E.coliΔASD DH10B，构建新的受体菌ΔASD DH10Bac/PGB2Ωinv；(3)引入外源基因获得重组ΔASDDH10Bac/PGB2Ωinv；(4)重组ΔASDDH10Bac/PGB2Ωinv直接感染与杆状病毒对应的昆虫细胞从而获得重组杆状病毒粒子。

本发明的理论依据：asd是编码二氨基庚二酸的基因，是细胞壁合成的重要成分，在确实asd基因的情况下，细菌必须补加DAP(二氨基庚二酸)以维持细菌的生存和繁殖。Inv基因来自Yersinia pesudotuberculosis的基因组，编码103kDa的细菌外膜侵染蛋白Invasin，Yersinia pesudotuberculosis可以感染人和动物，其感染主要方式是通过侵染蛋白Invasin与β1受体家族的结合，帮助细菌进入人或哺乳动物细胞。采用缺失大肠杆菌DH10B基因组中的asd基因，使大肠杆菌细胞壁合成受阻，大肠杆菌菌液和昆虫细胞混合后，通过PGB2Ωinv质粒表达的Invasin蛋白，与昆虫细胞上的受体结合，通过受体介导的内吞作用，大肠杆菌进入昆虫细胞，然后不再对其补加DAP，大肠杆菌在细胞内裂解，释放出DNA感染昆虫细胞。

采用上述技术方案的有益效果：

该方法可以不需要提取和纯化Bacmid DNA，只需要将携带重组Bacmid的细菌和昆虫细胞按一定的比例直接混合就可以获得感染性重组杆状病毒粒子。在侵染蛋白(invision protein)的帮助下，直接使用携带目的重组杆状病毒Bacmid DNA的细菌感染昆虫细胞，从而直接获得重组病毒粒子。从细菌到病毒，一步到位，省去了重组Bacmid的提取、纯化精制、Bacmid DNA与转染试剂的混合等复杂的转染程序，而生产重组病毒的效率为常规转染的4倍。因此该方法十分方便，快速和经济，为大规模构建重组病毒表达外源蛋白打下基础，是一种极具应用前景的新技术。

附图说明

图1是高效转座系统构建含重组Bacmid及直接生产重组病毒过程示意图；

图2是侵染蛋白辅助携带重组Bacmid-red的细菌在sf21细胞中直接生产病毒粒子；其中(A)是543nm荧光观察感染72小时后的sf21细胞，(b)是同一视野下普通光下观察感染72小时后的sf21细胞。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施例作进一步详细的说明。

应当说明的是，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；孙明主编，高等教育出版社，2006，基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚伦广编著)；黎路林编著，华中师范大学出版社，1996，杆状病毒表达载体系统，或按照制造厂商的操作指南所建议的方法进行。

实施例1：

构建ΔASDAcDH10Bac/PGB2Ωinv以及获得病毒粒子的方法

1.DAP营养缺陷型菌株E.coli ΔASD DH10B的构建

使用高效的GET重组系统进行E.coli DH10B染色体中asd基因缺失。以pcp15(两侧有FRT序列的Kn^r)为模板，扩增出带50bp同源重组臂和FRT序列的卡那抗性基因表达盒Kn^r。引物设计为ASD50UP：GAGACC GGCACAT TTATACAGCACACATCTTTGCAGGAAAAAAACGCTTAGAATTCGAGCTCGGTAC CCGGG(下划线表示asd基因50bp同源左臂)和ASD50DOWN：ASD50DOWN：CTCCTG TATTACGCACTAACAGGGGCGGCATCGCGCCCCAGATTAATGACTTA AGCTTAAAA GCGCTCTGAA(下划线为asd基因50bp同源右臂)。以质粒pcp15为模板进行扩增，产物大小为1.6kb(50bpLHA-FRT-kn^r-FRT-50bp RHA)，PCR产物首先使用DpnI充分酶切，去掉可能存在的模板质粒，然后经凝胶回收备用。

壮观霉素抗性质粒pML104含有由半乳糖启动子(Plac)控制的重组酶基因red和gam，经CaCl₂转化进DH10B。将DH10B/pml 104于30℃培养到OD₆₀₀为0.2，加入IPTG(0.4mM)继续培养30分钟，以诱导重组酶red和gam表达。然后将上述两则含50bp同源重组臂和FRT序列的卡那抗性基因PCR产物(50bpLHA-FRT-kn-FRT-50bp RHA)电转化进经IPTG诱导的DH10B菌株中，经Kn⁺平板(补加DAP)42℃筛选出阳性菌落，并经菌落PCR验证。用42℃培养目的是为了去掉温度敏感型质粒pML 104。菌落PCR引物为，Asdshortup：GAGACCGGCACATTTATACA；Asdshort down：CTCCTGTATTACGCA CTAAC。大肠杆菌基因组中asd基因大小为1.2kb，而含FRT序列的Kn^r大小为1.6kb。为方便以后Bacmid(kn^r)的引入，需要利用FLP重组酶将Kn^r去掉。将能表达FLP位点特异性重组酶和温度敏感型质粒pcp20转化进经过菌落PCR验证的菌落，筛选出卡那抗性基因被重组掉的阳性菌落(Kn^-，Amp⁺)，然后42℃培养去掉pcp20。经菌落PCR进一步确定阳性菌株，所得菌株命名为Δasd DH10B。

2.受体菌ΔASDAc DH10 Bac/PGB2Ωinv的构建

将AcBacmid(Kn^r，购自Invitrgen Bac-to-Bac系统)和转座辅助质粒pHelper(提供转座酶，Tet^r)以及表达侵染蛋白助手质粒PGB2Ωinv(PatriceCourvalin提供)电转化进E.coli ΔASDDH10B，在Kn/Tet/Sp/IPTG/X-gal/DAP平板上挑取蓝色阳性菌落，获得新的转座受体系统ΔASDAcDH10Bac。

3.重组ΔASD AcDH10Bac/PGB2Ωinv的获得

pDsRed经BamHI和NotI酶切，回收红色荧光蛋白基因red片段，按照常规方式克隆到载体pFastBacI，获得重组转移载体pFastBacI-red，按照Bac-to-Bac操作流程获得阳性白斑菌落，注意在培养基中补加DAP。

4.重组ΔASDAcDH10Bac/PGB2Ωinv直接感染Sf21细胞获得重组杆状病毒粒子。

如图(1)所示，挑取含重组Bacmid和助手质粒PGB2Ωinv白色单菌落，接种到5ml含kn(终浓度50ug/ml)和DAP(0.5mM)的LB培养基中，于37℃200rpm摇床培养到OD值约0.4左右，无菌条件下取400ul菌液至灭菌的1.5mlEppendorf，2500rpm离心5min，弃上清。无菌条件下加入1ml无血清无双抗的grace培养基(含0.5mM DAP)重悬沉淀。Sf21细胞置六孔板培养，待细胞汇片90％左右，去上清，加入500ul上述菌液和500ul grace基础培养基混合液感染昆虫细胞(moi＝100)。吸附两小时后，吸走上清，用1ml无血清，无双抗grace培养基洗两次，加入1ml含双抗，庆大霉素和10％血清的grace培养基，4天后即可收获重组病毒粒子上清。

重组病毒在细胞中的表达

选择重组Bacmid-red的阳性菌落进行培养，按照上述方法转染Sf21细胞后3—5天，置于倒置荧光显微镜下观察细胞中红色荧光的表达情况。如图2-A所示，转染后第4-5天，有大量的细胞发出红色荧光，而对照图2-B则没有细胞产生荧光。