厚壳贻贝酶解物的制备及其降血压肽的分离纯化、结构表征

摘要

贻贝是重要的世界性养殖品种，以新鲜贻贝为主要销售形式，经济效益低；作为传统的滋补食品，贻贝具有较高的营养价值和多种药理功效。本文以厚壳贻贝为原料，采用酶水解技术制备厚壳贻贝蛋白多肽，经超滤、凝胶过滤层析和RP-HPLC、质谱测序等手段对活性肽成分进行分离、纯化、结构表征，并通过体外试验验证，获得厚壳贻贝降血压肽。主要研究结果如下：
　　 分别用碱性蛋白酶(Alcalase2.4L)、中性蛋白酶(Neutrase)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、胰蛋白酶（Trypsin）和复合蛋白酶(Promatex)对厚壳贻贝蛋白进行水解，比较酶解物的水解度DH、蛋白质回收率及ACE抑制率，确定出水解厚壳贻贝蛋白的酶源为碱性蛋白酶；在碱性蛋白酶水解厚壳贻贝蛋白单因素试验的基础上，采用响应面设计进行试验优化，结合各因素对响应值的影响顺序，确定最优酶解条件为[E]／[S]2.18％、pH8.8，温度55℃，此条件下制备的厚壳贻贝酶解物的ACE抑制率为83.12％。
　　 采用5KD超滤膜对酶解物进行初步分离，收集流出液，所得组分MCP在对ACE抑制的IC50由超滤之前的0.367mg/mL降为0.308mg/mL。将该初步纯化的组分MCP进一步通过SephadexG-10凝胶层析分离，以超纯水为洗脱液洗脱，得到三个组分MCP-1、MCP-2和MCP-3，分别测其在对ACE抑制的IC50为0.739mg/mL、0.298mg/mL和0.163mg/mL，反复进样，选择活性最高的峰MCP-3收集。对MCP-3进行活性稳定性实验，结果显示，MCP-3对温度、酸碱变化以及消化酶均有不同程度的耐受性，随着温度或酸碱条件的变化，其对ACE的抑制活性均有良好的稳定性，体外模拟消化实验也表明MCP-3经胃肠道酶系消化后仍会保持较稳定的ACE抑制活性。此外，通过考察不同抑制剂浓度下，底物浓度变化与反应速率的关系，研究得出MCP-3对ACE的抑制类型为竞争性抑制。
　　 对MCP-3利用半制备型RP-HPLC进行进一步的分离纯化，得到5个主要的洗脱峰，分别进行活性测定，选择ACE活性抑制率最高的洗脱峰MCP-3-4进行收集，并利用分析型RP-HPLC对其进行纯度鉴定，结果显示，该组分在220nm和280nm的洗脱谱图中，只出现了一个单一的尖峰，说明MCP-3-4是个单一的肽段。通过液质联用进行序列分析，得到MCP-3-4为相对分子质量294.2的二肽，其一级序列结构为Glu-Phe。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

1.1 贻贝的研究进展

1.1.1 贻贝的种类及分布

1.1.2 贻贝的营养价值和药用价值

1.2 海洋生物多肽的功能活性

1.2.1 抗高血压活性

1.2.2 抗氧化活性

1.2.3 免疫调节作用

1.2.4 抗肿瘤活性

1.2.5 抗菌活性

1.2.6 抗凝血活性

1.2.7 其他活性

1.3 海洋生物多肽的提取及分离纯化

1.3.1 膜分离法

1.3.2 离子交换层析

1.3.3 凝胶过滤层析

1.3.4 反相高效液相色谱

1.4 立题依据及研究内容

1.4.1 立题依据

1.4.2 研究内容

第2章 蛋白酶的筛选及酶解工艺条件的优化

2.1 材料与仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 基本成分的测定

2.2.2 蛋白酶活力的测定

2.2.3 厚壳贻贝蛋白酶解工艺

2.2.4 厚壳贻贝蛋白水解用酶的筛选

2.2.5 厚壳贻贝蛋白最佳酶解条件的优化

2.2.6 水解度(DH)的计算

2.2.7 蛋白回收率的测定

2.2.8 体外降血压活性的测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 基本成分分析结果

2.3.2 蛋白酶活力测定结果

2.3.3 蛋白酶的筛选

2.3.4 碱性蛋白酶水解厚壳贻贝蛋白的单因素试验

2.3.5 响应面法优化酶解最佳工艺

2.4 小结

第3章 厚壳贻贝降血压肽的初步分离纯化及性质研究

3.1 材料与仪器

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 HPLC测定酶解物的分子量分布

3.2.2 超滤初步分离MCHS

3.2.3 凝胶过滤层析

3.2.4 凝胶层析分离峰收集液的活性稳定性测定

3.2.5 凝胶层析分离峰收集液的ACE抑制动力学研究

3.3 结果与讨论

3.3.1 酶解物分子量的分布

3.3.2 超滤前后酶解物的组成及ACE抑制活性的比较

3.3.3 凝胶层析分离厚壳贻贝粗多肽MCP的结果

3.3.4 凝胶层析分离峰MCP-3的活性稳定性测定结果

3.3.5 MCP-3的ACE抑制动力学结果分析

3.4 小结

第4章 RP-HPLC分离纯化降血压肽及其结构表征

4.1 材料与仪器

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 半制备RP-HPLC分离纯化ACE抑制肽

4.2.2 RP-HPLC分析ACE抑制肽

4.2.3 液质联用测定肽序列

4.3 结果与讨论

4.3.1 半制备RP-HPLC分离纯化ACE抑制肽

4.3.2 分析型RP-HPLC鉴定MCP-3-4的纯度

4.3.3 肽序列结构分析

4.4 小结

第5章 结论、创新点与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

附录一 研究生期间发表论文及专利

致谢