大黄鱼源Shewanella baltica群体感应LuxS蛋白及cyclo-(L-Pro-L-Leu)信号分子功能研究

摘要

近年来，许多学者对食品腐败菌中群体感应(Quroum sensing，QS)现象产生兴趣。波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）为革兰氏阴性嗜冷菌，是多种海产品的特定腐败菌(Specific spoilageorganisms，SSO)。前期研究表明，大黄鱼源S.baltica中存在AI-2和二酮哌嗪类(Diketopiperazine，DKPs)信号分子，其中cyclo-(L-Pro-L-Leu)外源刺激能够促进S.baltica的腐败能力。然而，S.baltica QS系统的分子信息及感应受体蛋白与其调控腐败基因的机制的研究较少。鉴于此，本研究以冷藏大黄鱼中分离鉴定的特定腐败菌S.baltica SB11为研究对象，从生物信息学角度分析S.baltica LuxR家族蛋白和AI-2合成酶LuxS蛋白;构建和验证luxS基因缺失株，比较研究其对生长、生物被膜及致腐表型的影响;基于转录组学研究外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)对S.baltica的基因表达及代谢通路的影响，旨在更加全面地了解S.baltica的QS系统，为新型保鲜剂的研发提供理论支持。主要结果如下:
　　利用生物报菌法、高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)、气相色谱(GC)检测了S.baltica SB11培养上清中信号分子，发现S.baltica SB11上清液中含有AI-2和cyclo-(L-Pro-L-Leu)、cyclo-(L-Pro-L-Phe)信号分子，而无AHLs活性。生物信息学分析发现S.baltica BA175基因组中无luxI同源基因，而共发现11个luxR家族同源基因，其中8个LuxR家族蛋白与双组份系统相关，接着与8个已知的QS受体LuxR蛋白进行进化树和保守氨基酸分析，发现NCBI中蛋白序列号为AEG10146.1与AEG11800.1可能为LuxR solo蛋白，并在S.baltica SB11基因组中扩增出对应的luxR基因。同时，在S.baltica SB11中扩增出luxS基因，由510个碱基即169个氨基酸构成，BLASTP结果表明其与S.baltica、腐败希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、创伤弧菌(Vibriovulnificus)等LuxS蛋白氨基酸序列相似度较高，相似度均超过80％，与S.baltica BA175的LuxS蛋白氨基酸序列相似度更是达到100％。进化树及蛋白序列二级结构分析发现，S.baltica SB11 LuxS蛋白较为保守，拥有组氨酸(His-54)、组氨酸(His-58)和谷氨酸(Glu-57)与半胱氨酸(Cys-127)组成的二价锌离子的结合位点，以及对LuxS活性起重要作用的丝氨酸(Ser-6)，组氨酸(His-11)和精氨酸(Arg-39)，谷氨酸(Glu-93)等保守氨基酸，三维结构模拟显示该LuxS蛋白由4个α螺旋和5个β折叠片构成，两个亚基表面均有一个锌离子结合位点，与多种菌的LuxS蛋白空间结构相似。
　　构建S.baltica SB11 luxS基因缺失株，采用PCR扩增与AI-2活性验证缺失株luxS基因已成功缺失，并比较分析在4℃以及28℃条件下野生株与缺失株的生长、生物被膜及胞外多糖形成和粘附能力、泳动能力、蛋白酶活性、腐败代谢物、蛋白表达的差异。研究发现，在4℃和28℃下S.baltica野生株SB11和luxS基因缺失株ΔSB11的生长无显著差异。相对于野生株，缺失株ΔSB11生物被膜的形成显著减少，4℃下培养96 h后，其生物被膜总量只有野生株的80％，而在28℃下培养24 h后，其总量仅为野生株的72％。相似地，缺失株ΔSB11胞外多糖含量也显著低于野生株SB11(P＜0.05)，4℃条件下培养120h仅为0.051 mg/mL，而野生株为0.060 mg/mL，28℃条件培养24 h为0.056 mg/mL，而野生株为0.064 mg/mL。同时，S.baltica luxS基因缺失株在不锈钢片上的粘附能力也明显减弱，在4℃下培养72 h，野生株与缺失株粘附量分别为7.25和6.78 Log10 CFU/cm2，在28℃培养24 h后粘附量分别达到6.85与6.40 Log10 CFU/cm2。荧光显微镜观察显示，野生株SB11能快速粘附于盖玻片表面，聚集并形成大量生物被膜，而缺失株ΔSB11更倾向于形成平坦稀疏的生物被膜，而且细菌并不聚集成团。同时野生株和缺失株的泳动性存在差异(P＜0.05)，4℃培养72 h后，突变株和的野生株扩散直径分别32.3和25.9 mm，28℃下培养48 h后其扩散直径分别为71.2和53.5 mm。然而，野生株SB11和缺失株ΔSB11在4℃和28℃条件下蛋白酶活性和腐败代谢产物三甲胺、腐胺的形成无显著差异。4℃冷藏条件下，鱼汁中细菌生长和挥发性盐基氮的积累，两株菌也无明显不同。结果表明，luxS基因缺失减弱S.baltica的生物被膜和粘附能力，促进泳动性，但不影响S.baltica的致腐表型和能力。SDS-PAGE也显示与野生株相比，缺失株中蛋白表达发生变化，其蛋白质量主要集中在28～44.3 KDa,蛋白表达差异可能与生物被膜形成和泳动能力的变化存在一定相关。外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)不影响S.baltica SB11的生长，对生物被膜形成、泳动、粘附能力、脂酶活性及三甲胺、挥发性盐基氮形成却有明显促进作用。转录组学分析显示，外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)在培养4h和12h后分别发现130个和89个显著性差异基因，其中培养4h及12h的处理组与对照组相比分别共有122个及65个基因上调，影响S.baltica核糖、碳代谢、脂肪酸代谢、双组份系统，鞭毛组装，细菌趋化等多条代谢通路。多种粘附相关基因，如调控细菌胞外蛋白纤维(Curli) CsgAB操纵子的转录管理基因、TypeⅤ菌毛的稳定蛋白pilW基因及与荧光假单胞菌lapA同源的bpfA基因的表达均有明显上调，可能参与促进S.baltica SB11的粘附及定植作用。fliM、 flgD、fliA、甲基受体趋化蛋白基因等多个鞭毛及趋化运动相关的基因上调，可能参与增强细菌的运动能力。研究也发现，c-di-GMP合成酶二鸟苷酸环化酶基因上调，该酶可以通过合成c-di-GMP促进生物被膜形成。同时在培养12h后，一些腐败相关基因如torF、torA、ODC等基因均有上调，与表型结果代谢产物的增加呈正相关。另外，转录组学分析显示外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)4h后，LuxR蛋白（蛋白序列号为AEG11800.1）对应的基因表达量显著上升，表明该蛋白对cyclo-(L-Pro-L-Leu)具有感应，提示其可能为LuxR solo蛋白。
　　实时荧光定量PCR结果显示外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)培养4h及12h后，fliA、torA和ODC基因的表达量与转录组测序结果一致，表明转录组测序结果较为可靠。
　　综上所述，腐败菌S.baltica SB11具有AI-2及cyclo-(L-Pro-L-Leu)、cyclo-(L-Pro-L-Phe)活性，发现该菌存在一个LuxR家族蛋白可能为QS受体LuxR solo蛋白，而LuxS蛋白较为保守，为LuxS蛋白家族的功能蛋白。luxS缺失株显著减弱生物被膜形成和粘附能力，但不参与调控该菌的腐败能力。外源cyclo-(L-Pro-L-Leu)能够增强S.baltica致腐表型，转录组学分析提示这可能与cyclo-(L-Pro-L-Leu)添加后，粘附、泳动、腐败等相关基因的表达上调有关。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 群体感应

1．1．1 群体感应的定义

1．1．2 群体感应类型

1．1．3 AHLs介导的群体感应系统

1．1．4 AI-2介导的群体感应系统

1．1．5 DKPs介导的群体感应系统

1．1．6 其它信号分子介导的群体感应系统

1．2 群体感应与食品腐败菌

1．2．1 奶类制品中腐败菌的群体感应

1．2．2 肉制品中腐败菌的群体感应

1．2．3 水产品中腐败菌的群体感应

1．2．4 果蔬中腐败菌的群体感应

1．3 群体感应与食源性细菌生物被膜形成

1．3．1 细菌生物被膜的定义

1．3．2 生物被膜的形成步骤

1．3．3 食源性细菌生物被膜与群体感应的联系

1．4 本课题的研究目的、意义和内容

第二章 S．baltica群体感应相关蛋白LuxR和LuxS生物信息学分析

2．1 前言

2．2 材料与设备

2．2．1 菌种及培养条件

2．2．2 试剂

2．2．3 主要仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 信号分子的提取

2．3．2 生物报告菌检测信号分子

2．3．3 LC-MS／MS检测AHLs信号分子

2．3．4 V．harveyi BB170生物报告菌法检测AI-2活性

2．3．5 气相色谱法检测S．baltica SB11上清液中DKPs信号分子

2．3．6 两个luxR及luxS基因PCR扩增及序列分析

2．3．7 S．baltica SB11中luxR和luxS基因的分析

2．3．8 S．baltica SB11中LuxR和LuxS蛋白序列分析及进化树构建

2．3．9 S．baltica SB11中LuxS蛋白结构模拟

2．4 结果与分析

2．4．1 S．baltica SB11上清中QS信号分子的活性

2．4．2 S．baltica BA175中LuxR家族同源蛋白分析

2．4．3 S．baltica BA175中LuxR家族同源蛋白进化树分析

2．4．4 S．baltica可能的LuxR solo蛋白氮基酸和功能预测分析

2．4．5 S．baltica SB11中luxS基因扩增及蛋白序列分析

2．5 讨论与分析

第三章 luxS基因缺失对S．baltica生物被膜和致腐表型的影响

3．1 前言

3．2 材料与设备

3．2．1 细菌及培养条件

3．2．2 培养基和主要试剂

3．2．3 仪器设备

3．3 实验方法

3．3．1 S．baltica SB11菌株luxS基因扩增与缺失株的构建

3．3．2 △luxS菌株的AI-2活性检测

3．3．3 SB11与△luxS的生长曲线的绘制

3．3．4 SB11与△luxS生物被膜测定

3．3．5 珠涡流法测定粘附能力及荧光显微镜观察

3．3．6 SB11与△luxS胞外多糖含量测定

3．3．7 SB11与△luxS泳动性测定

3．3．8 SB11与△luxS蛋白酶活性测定

3．3．9 SB11与△luxS TMA含量测定

3．3．10 SB11与△luxS腐胺含量测定

3．3．11 SB11与△luxS在大黄鱼灭菌鱼汁中腐败能力测定

3．3．12 SDS-PAGE电泳检测总蛋白

3．4 数据处理和制图

3．5 结果与分析

3．5．1 缺失株luxS基因缺失验证

3．5．2 luxS基因缺失对S．baltica生长的影响

3．5．3 luxS缺失对S．baltica生物被膜的影响

3．5．4 luxS基因缺失对S．baltica粘附能力的影响

3．5．5 解基因缺失对S．baltica泳动能力的影响

3．5．6 luxS基因缺失对S．baltica水溶性胞外多糖含量的影响

3．5．7 luxS基因缺失对S．baltica胞外蛋白酶活性的影响

3．5．8 luxS基因缺失对S．baltica三甲胺形成的影响

3．5．9 luxS缺失对S．baltica腐胺形成的影响

3．5．10 luxS缺失对S．baltica在鱼汁中生长和TVB-N积累的影响

3．5．11 luxS缺失对S．baltica总蛋白表达差异的影响

3．6 讨论

第四章 基于转录组学分析二酮哌嗪类信号分子cyclo-(L-Pro-L-Leu)对S．baltica致腐的调控作用

4．1 前言

4．2 材料与仪器

4．2．1 主要试剂和培养基

4．2．2 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 信号分子的配置

4．3．2 生长曲线的绘制

4．3．3 结晶紫法测定生物被膜形成量

4．3．4 粘附能力

4．3．5 泳动能力的测定

4．3．6 脂肪酶活性的测定

4．3．7 三甲胺形成能力测定

4．3．8 TVB-N形成能力测定

4．3．9 转录组学测序

4．3．10 荧光定量PCR验证

4．4 数据处理和分析

4．5 结果与分析

4．5．1 外源cyclo-(L-Pro-L-Leu)添加对S．baltica SB11表型的影响

4．5．2 Cyclo-(L-Pro-L-Leu)刺激下S．baltica的转录组学分析

4．5．3 荧光定量PCR验证

4．6 讨论

第五章 总结、展望和创新点

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

致谢

附录

攻读硕士学位期间主要研究成果

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