羊栖菜多糖酶解产物及其分离纯化组分的生物活性研究

摘要

羊栖菜，一种流行于亚洲的可食褐藻，主要分布于太平洋西部温带海岸线附近。除了食用价值，羊栖菜还具有药用价值，上千年来用来治疗淋巴结核、水肿、消化不良、气滞等疾病。以羊栖菜为代表的褐藻中含有各种具有健康益处的生物活性成分，尤其是其中的酸性多糖。由于羊栖菜价格低廉，分布广泛，因此将羊栖菜加工为功能性食品或开发成低副作用的药物具有良好的研究前景。羊栖菜中碳水化合物的含量较高，但其中的粗多糖可利用的生物活陛相对偏低。为了对羊栖菜多糖进一步研究，提高生物活性，本文以羊栖菜粗多糖为原料，选取果胶酶和糖化酶复合的方案进行降解，并研究了酶解后多糖的生物活性。在此基础上继续对酶解后多糖进行分离与纯化，研究纯化组分的生物活性，为研发羊栖菜多糖功能性食品提供理论依据。 主要研究结果如下: 1.用水提醇沉法提取羊栖菜粗多糖(SFP)，采用果胶酶和糖化酶复合酶解法对其进行降解得到酶解羊栖菜多糖(ESFP)。根据单因素实验与响应面分析相结合得到酶解最优工艺方案:温度为54.2℃，酶浓度为68.4 U/mL，酶比为3.3:1，反应时间为3h。在此条件下，多糖的酶解率为18.57％。 2.对SFP和ESFP的化学组分分析，结果表明降解前后的总糖、糖醛酸、硫酸根含量均有所增加，蛋白质含量变化不大。经紫外光谱和红外光谱扫描结果分析可知样品的纯度良好，且酶解并没有破坏多糖分子结构和活性基团。SFP和ESFP的相对分子质量分别是12.56万和8.68万，单糖组成分析表明SFP和ESFP主要是由Fuc、Gal、Man组成，还含有少量的Glu和Xyl。 3.对SFP和ESFP的体外抗氧化活性进行研究分析，结果显示:在还原力和自由基(·DPPH、·OH、·O2-)清除实验中ESFP的体外抗氧化活性均显著高于SFP的活性;对SFP和ESFP的体外胆酸结合活性进行研究分析表明:SFP与ESFP与胆酸钠和鹅去氧胆酸钠均有较好的结合能力，但是ESFP活性明显优于SFP，相当于消胆胺的50％左右。 4.酶解多糖经过纤维素DEAE-52柱与SephadexG-100柱分离纯化，得到均为酸性多糖的4个组分，分别为ESFP1、ESFP2、ESFP3、ESFP4。紫外扫描结果显示ESFP1、ESFP2、ESFP3在260～280 nm处都无明显吸收峰出现，说明这三个组分中核酸和蛋白质等杂质含量很低，而ESFP4在280 nm有很低的吸收峰，说明该组分多糖分子上可能结合有少量糖蛋白;高效凝胶渗透色谱(HPGPC)分析结果显示ESFP1、ESFP2、ESFP3和ESFP4峰型为单一峰，说明他们纯度较好。对4个纯化组分化学组成分析结果表明: ESFP1、ESFP2、ESFP3、ESFP4糖醛酸含量分别为10.12％、7.92％、6.72％、1.76％;蛋白质含量分别为0.96％、1.04％、1.10％、1.18％;硫酸根含量分别为8.76％、9.89％、10.03％、10.68％。测得ESFP1、ESFP2、ESFP3、ESFP4的相对分子质量分别为7.55万、8.63万、7.62万、8.65万。单糖组成主要是由Fuc、Gal、Man组成，还含有少量的Glu和Xyl。 5.ESFP1、ESFP2、ESFP3与ESFP4体外抗氧化活性结果:铁还原能力由大到小为ESFP4＞ESFP3＞ESFP2＞ESFP1;对DPPH的清除效果ESFP1＞ESFP2＞ESFP3＞ ESFP4，且IC50分别是0.071、0.228、0.375和0.703 mg/mL;·O2-自由基清除能力ESFP4＜ ESFP3＜ ESFP1＜ESFP2，且IC50值分别为0.432、0.131、0.225、0.371 mg/mL;·OH的清除能力ESFP1＞ESFP2＞ESFP3＞ESFP4，在5 mg/ml的样品浓度下，清除率分别为85.4％、78.8％、72.4％、20.7％。 6.对RAW264.7细胞的免疫调节活性结果表明:(1) SFP、ESFP、ESFP1、ESFP2、ESFP3与ESFP4这6个样品对RAW264.7细胞增殖活性的影响随着浓度增大呈先增加后减弱的趋势，且ESFP活性大于SFP活性，ESFP各纯化组分活性大小依次为ESFP3＞ESFP2＞ESFP1＞ESFP4;(2)6个样品对RAW264.7细胞吞噬活性的影响均随着浓度增大呈先增加后减小的趋势，且ESFP活性大于SFP活性，ESFP各纯化组分活性强弱依次为（按照峰值数值）:ESFP2＞ESFP1＞ESFP3＞ESFP4;(3)6个样品促进细胞产生NO的活性均随着浓度的增大而增加，且ESFP活性大于SFP活性，ESFP各纯化组分活性强弱依次为（按照峰值数值）ESFP2＞ESFP1＞ESFP3＞ESFP4。细胞免疫调节活性最好的组分为ESFP2，而SFP的活性最差。

目录

摘要

第1章引言

1．1羊栖菜及羊栖菜多糖的研究进展

1．1．1羊栖菜概况

1．1．2羊栖菜的化学组成

1．1．3羊栖菜多糖及其生物活性

1．2．1降血脂的研究进展

1．2．2胆汁酸的研究进展

1．3多糖的分离纯化

1．4 RAW264．7巨噬细胞

1．5本课题研究背景及意义

1．6本课题研究内容

第2章羊栖菜多糖的提取及复合酶法降解多糖的工艺优化

2．1实验材料与设备

2．1．1实验材料与试剂

2．1．2实验设备

2．2实验方法

2．2．1羊栖菜多糖的提取及制备

2．2．2羊栖菜粗多糖的降解

2．3结果与分析

2．3．2 DNS法测还原糖

2．3．3复合酶解羊栖菜粗多糖的单因素实验结果

2．3．4响应面优化实验结果

2．3．5复合酶反应时间的确定

2．4小结

第3章羊栖菜多糖及其酶解产物活性的研究

3．1实验材料与设备

3．1．1实验材料与试剂

3．1．2实验设备

3．2实验方法

3．2．1羊栖菜多糖的理化性质分析

3．2．2羊栖菜多糖体外抗氧化实验

3．2．3胆酸结合活性试验

3．3结果与分析

3．3．1羊栖菜多糖的理化性质分析

3．3．2体外抗氧化研究

3．3．3体外胆酸结合能力

3．4本章小结

第4章复合酶解多糖的分离纯化与各纯化组分对RAW264．7细胞免疫调节活性的研究

4．1实验材料及设备

4．1．1实验材料

4．1．2实验设备

4．2实验方法

4．2．2 Sephadex G-100凝胶纯化羊栖菜酶解多糖粗分离物

4．2．3各纯化组分分析

4．2．4各纯化组分的体外抗氧化活性研究

4．2．5各纯化组分对RAW264．7细胞的免疫调节的活性研究

4．3结果与分析

4．3．2 Sephadex G-100柱层析纯化结果

4．3．3各纯化组分分析结果

4．3．4各纯化组分的体外抗氧化活性研究

4．3．5各纯化组分对RAW264．7细胞的免疫调节的活性研究

4．4本章小结

第5章结论、创新点与展望

5．1结论

5．2创新点

5．3展望

参考文献

附录

致谢

声明