蚯蚓活性组分的分离纯化及其生物活性研究

摘要

目前肝细胞的损伤和凋亡导致多种肝脏疾病的发生发展，内质网应激又在肝细胞的凋亡中占重要地位，这也成为人们研究肝脏疾病的热点。蚯蚓由于其价格低廉、副作用小、药理活性显著等优点，入药治疗肝脏疾病在临床上得到应用，但其成分复杂又限制了蚯蚓在临床上的深入应用。本研究的目的是希望从蚯蚓中得到一种具有促进肝脏损伤修复和再生的活性组分，初步探讨其理化性质和生物活性机制，为蚯蚓制剂在临床上的应用提供实验基础和理论依据。本实验分为两部分。　　一、蚯蚓活性组分(EWAs)的分离纯化。　　目的：本实验旨在建立提取分离纯化具有生物活性的EWAs方法。　　方法：本实验选用冰鲜赤子爱胜蚯蚓，按照胶体磨匀浆、离心（55rpm，20min）、醇沉（55％乙醇）、葡聚糖凝胶 G25脱盐、超滤截留、阳离子交换层析等步骤提取EWAs，并对其理化性质进行初步研究。　　结果：EWAs收率为0.18%，外观为白色絮状物，分子量大约在4.6-16KD，极易溶于水，蛋白含量为27.4%。具有促进受损人正常肝细胞系（L02细胞）修复与再生的生物活性。　　结论：本实验成功建立了EWAs的提取分离纯化方法。　　二、EWAs体内生物活性研究。　　目的：旨在探讨EWAs对四氯化碳（CCl4）诱导小鼠内质网应激（ERS）所致急性肝损伤的保护作用。　　方法：将50只健康雄性小鼠随机分为5组：正常组、模型组、EWAs低剂量组(EWAsL)：3mg·kg-1·d-1、EWAs中剂量组(EWAsM)：6mg·kg-1·d-1、EWAs高剂量组（EWAsH)：12mg·kg-1·d-1。正常组和模型组每天皮下注射等体积生理盐水，给药组皮下注射不同剂量 EWAs，连续10d。末次给药8h后，除正常组外，其余组腹腔注射10% CCl4大豆油溶液（0.1ml·10g-1）制备内质网应激所致急性肝损伤模型；禁食不禁水，24h后，摘眼球取血，脱臼处死，摘取肝脏及脾脏，称重，计算肝、脾指数。血清生化指标检测 ALT、AST、SOD、GSH-PX酶活性及 MDA含量变化；HE染色观察肝脏病理学变化；TUNEL法检测肝组织细胞凋亡情况；免疫组织化学法检测 ERS标志性蛋白 GRP78和 CHOP表达情况；Western blot法检测肝组织中ERS相关蛋白的表达水平。　　结果：与模型组小鼠相比，EWAs的高、中、低剂量组血清学各项指标均有显著改善，肝脏病变范围减小，且损伤程度明显减轻，小鼠肝脏指数和脾脏指数均有明显变化；各剂量给药组的肝组织细胞凋亡指数明显下降；肝组织中 ERS相关蛋白GRP78和CHOP表达水平显著降低，各剂量给药组均能显著下调 GRP78和 CHOP以及 CHOP上游信号通路 PERK-eIF2α-ATF4的蛋白表达。　　结论：EWAs对 ERS所致的小鼠急性肝损伤具有显著保护作用，其机制可能是通过抑制氧化应激和 ERS，下调ERS标志性凋亡蛋白 CHOP表达，从而减轻肝脏损伤、抑制细胞凋亡实现的。

目录

声明

第1章 前言

1.1 蚯蚓研究进展

1.2 内质网应激介导细胞凋亡

1.3 ERS介导细胞凋亡所致的肝损伤

1.4 总结与展望

第2章 蚯蚓活性组分分离纯化

2.1 前言

2.2 材料

2.3 EWAs分离纯化实验方法

2.4 结果

2.5 讨论

第3章 蚯蚓活性组分生物活性研究

3.1 前言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果

3.5 讨论

第4章 结论

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读学位期间的研究成果