Trichoderam reesei GXC中β-1,3-1,4-葡聚糖酶cDNA片段的克隆和测序

摘要

该研究以Trichoderma reesei GXC菌株作为β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶源供体.Trichoderma reesei GXC菌株在30℃ PYD培养基中震荡培养2-3天,至对数生长期.用TPIZOL法 提取RNA,通过紫外分光光度计测得OD260/OD280值为1.8-2.0之间,以此RNA为模板,用特异性引物P4进行反转录,分别以特异引物P1,P4和P2,P3做套式PCR,扩增得到一特异性条带 ,以测序,其长度为285bp.与GenBank中该酶其他序列进行同源性分析.在此基础上设计引物P5,P6,P7,用RACE(快速扩增cDNA末端,Rapid Amplificatiom if cDNA Ends)方法,扩增得到一条长300bp左右的5'端片段,两条3'端片段,分别为500bp和200bp左右.从电泳图 中可以看出,500bp片段浓度大大高于200bp,其长度也更接近于目的片段,因而对3'端500bp以及5'端300bp左右的片段割胶回收,并进行克隆.经酶切鉴定得到3A<,2>,3A<,3>,3A<,6>(3'端)和5A<,1>,5A<,3>,5A<,5>(5'端)6个阳性重组克隆子.测序结果,5'端为一长295bp的cDNA序列,除部分序列之外,5'端大部分序列与其它菌种中该酶的5'端同源性不高.

目录

文摘

致谢

第一章前言

第二章β-葡聚糖酶中间段cDNA的克隆与测定

1.1材料和方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1 β-葡聚糖酶基因的克隆与部分序列

第三章β葡聚糖酶3'两端5'cDNA的克隆和测定

3.1材料和方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2.2结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

附录一