丁酸梭菌体外粘附抗菌特性及对鮸鱼肠道生理的影响

摘要

随着水产养殖的规模化和集约化，水产动物的健康养殖面临着挑战。而抗生素和抗菌药物长期使用，造成诸如细菌抗药性、耐药基因的转移、水产品中药物残留等不良后果，直接或间接威胁人类健康。益生菌即微生态制剂，是一类能够调节水产动物肠道微生态平衡，改善水体环境，增强机体免疫，促进消化、抵御病原菌侵袭的活的微生物。益生菌的使用是安全有效环保的，因此研究和开发水产用益生菌菌株对促进水产养殖有着重要的意义。 丁酸梭菌(Clostridium butyicum)，即丁酸梭菌，常作为益生菌用来防治由于多种因素引起的人和动物的腹泻、肠炎等疾病。本次实验研究丁酸梭菌在体外粘附抑制鱼常见病原菌的情况，及其对娩鱼肠道生理的影响。试验分三部分：(一)分离和培养鮸鱼肠道上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)，建立肠道上皮细胞的研究模型；(二)丁酸梭菌在IEC模型上的粘附，抑制病原菌粘附作用，及细胞安全性评价；(三)通过饲喂实验，观察其对鮸鱼肠道组织形态、消化酶、肠内短链脂肪酸、肠壁微生物的影响。 主要研究结果如下： 1 采用Ⅳ型胶原酶、Ⅰ型胶原酶和 EDTA 消化鱼肠道中段分离 IEC 细胞，以贴壁时间的不同纯化IEC，并缩短处理时间，即可获得有活力的、较纯的 IEC，呈单层生长，可作为试验的模型。 2丁酸梭菌能够粘附于肠上皮细胞，粘附率8.03％，且不侵袭细胞，粘附后对细胞损伤相较低。丁酸梭菌能降低鳗弧菌的粘附率，其中竞争试验，粘附率降低6.71％；排斥试验，粘附率降低8.27％；替代试验，粘附率降低4.47％。 3通过饲喂丁酸梭菌，能提高鱼的消化酶活性，影响肠内短链脂肪酸，其中丁酸尤为明显，中后肠浓度分别增加了2.09mmol/kg、2.12mmol/kg。肠绒毛高度增高，中肠提高了28.81μm，后肠提高了34.23μm。上皮细胞上微绒毛高度增高，中肠和后肠分别增高了1.891μm，1.09μm。电镜下观察，可见后肠肠壁上细菌定植。 结论： 丁酸梭菌具有粘附能力，不存在致病因素，能竞争的抑制肠内致病原微生物，改善肠道消化生理，增加肠内SCFA，增强肠内消化酶活性，提高肠道绒毛高度。采用IEC模型，体外研究丁酸梭菌的粘附及抑制，在一定程度上能够反映体内的菌群互作，具有一定的参考价值。

目录

引言

第一章研究综述

第一节抗生素在水产养殖中的应用及面临的挑战

1鱼类病原菌

2抗生素在水产养殖业中的积极作用

3抗生素在水产养殖业中的负面作用

第二节益生菌在水产动物中的应用研究概况

1鱼类肠道的正常菌群及作用

2鱼类肠道菌群的形成、数量和组成

3益生菌的定义

4益生菌作为生物控制剂在鱼类养殖中的应用

5益生菌的作用机理

第三节益生菌在肠道内粘附机制的研究进展

1粘附的一般特征

2粘附素

3粘附素受体

4研究前景

第二章鱼肠道上皮细胞的体外培养

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.2方法

2结果与分析

3讨论

第三章丁酸梭菌对肠道上皮细胞的粘附及抑菌作用的研究

1材料和方法

1.1细菌制备

1.2肠道上皮细胞

1.3丁酸梭菌粘附率测定

1.4侵袭实验

1.5粘附对细胞损伤的影响

1.6细胞存活率的测定

1.7丁酸梭菌抑制鳗弧菌粘附实验

2结果

2.1丁酸梭菌对细胞的粘附和侵袭

2.2粘附对细胞损伤的影响

2.3粘附对细胞存活率的影响

2.4抑制鳗弧菌粘附细胞作用

3讨论

3.1粘附实验研究方法

3.2丁酸梭菌的粘附

3.3丁酸梭菌与鳗弧菌的相互作用

3.4细胞损伤及存活率的影响

3.5结论

第四章丁酸梭菌对鮸鱼肠道形态、肠内消化酶、短链脂肪酸及微生态的影响

1材料和方法

1.1试验材料

1.2试验动物

1.3试验日粮

1.4试验地点

1.5饲养试验

2样品收集和分析

2.1生产性能

2.2解剖试验

2.3肝胰脏和肠组织消化酶测定

2.4肠组织切片的制作

2.5肠道内短链脂肪酸的测定

2.6数据统计

3结果与分析

3.1鮸鱼的生长性能

3.2肝脏、幽门盲囊和肠道消化酶

3.3肠道绒毛及微绒毛的影响

3.4肠道内SCFA的影响

3.5肠道内壁生态观察

4讨论

4.1生长

4.2肝胰脏和肠组织消化酶

4.3肠道内SCFA的影响

4.4肠道组织结构

4.5肠道内壁生态观察

4.6结论

结语

创新点

参考文献

致谢

附录