建兰花叶病毒单克隆抗体制备及其检测应用

摘要

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus，ORSV)是兰花上分布最广、危害最严重的两种病毒，严重影响了其经济价值和观赏价值。本实验主要从生物学、血清学、电镜技术方面对两种病毒进行了鉴定，并制备了建兰花叶病毒的单克隆抗体，建立了抗原包被的ACP-ELISA检测方法。研究工作取得的主要结果如下： 1．CymMV和ORSV的鉴定经2％磷钨酸负染和CymMV、ORSV抗血清间接ELISA方法筛选到的分别含有线状病毒和杆状病毒粒子的蝴蝶兰病叶汁液摩擦接种藜科、茄科和葫芦科3科9种指示植物，发现：所有被病毒侵染的植物均不显示系统症状。接种CymMV阳性兰花病叶汁液的曼陀罗、昆诺藜只有局部坏死斑和褪绿斑，苋色藜上无症状。接种ORSV阳性兰花病叶汁液的苋色藜、昆诺藜呈现与曼陀罗相同的症状。两种病毒均不侵染普通烟、三生烟、珊西烟、心叶烟、本氏烟和黄瓜。SDS-PAGE电泳蛋白分析表明，CymMV和ORSV提纯病毒样品各自只出现一条蛋白带，分子量分别约为27kD和17 kD。间接ELISA检测结果显示两种提纯病毒与TuMV、PVX、PVY、TMV单抗均无反应。电镜下观察超薄切片，可看到：感染CymMV的叶片细胞内有带状病毒内含体，感染ORSV叶片细胞质内有层间倾斜排列的结晶体。此外，还进行了免疫胶体金标记。感染CymMV叶片细胞质内带状病毒内含体上胶体金颗粒分布密集，感染ORSV的叶片细胞质内病毒内含体上也集中了较多的胶体金颗粒，健康叶片的细胞内几乎没有金颗粒。以上结果表明我们从兰花上分离到的两种病毒分别为CymMV和ORSV。 2．CymMV单克隆抗体的制备及其检测方法的建立用建兰花叶病毒(CymMV)免疫的BALB/c鼠脾细胞与Sp2/0鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆，获得2C6、587和12G9共3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(MAbs)的杂交瘤细胞，3株单抗都仅对CymMV有特异性反应，而与BBWW-1、BBWV-2、CarMV、PVY、TMV、ToMV、TuMV、LSV、ToYMV和CMV等病毒均无交叉反应。Western-blot印记分析表明，3株单抗只与CymMV的27kD外壳蛋白有特异反应。其中587和12G9 2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10<'-6>。抗体类型及亚类鉴定显示，3株抗体的抗体类型及亚类均为IgG1，轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接EIASA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法，灵敏度高。病叶作1∶10240倍稀释，每孔的病毒绝对量为0.487ng时，该方法仍能检测到病毒。利用制备的单抗和建立的 ACP-ELISA方法对浙江海宁、四川成都、浙江大学农场、北京4地的87个兰花样品进行检测，发现有54个样品呈强阳性，阳性率高达62.1％，说明兰花上CymMV的感染率很高。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章文献综述

1兰花的起源与分布

1.1兰花的分布与分类

1.2兰花的经济意义

1.3兰花上的主要病害

2兰花病毒病的研究进展

2.1危害兰花的主要病毒

2.2建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒粒体结构

2.3病毒传播途径及介体

2.4株系与血清学

2.5兰花病毒的检测技术

2.6兰花病毒病防治方法

3单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用

3.1抗体的基本结构特性

3.2单克隆抗体技术

3.3单克隆抗体在植物病毒学中的应用

3.4植物病毒学中常用的血清学检测方法

4选题意义、研究内容及目的

4.1选题意义

4.2研究内容及目的

第二章建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的分离和纯化

1材料

1.1毒源采集与保存

1.2抗血清

1.3指示植物

1.4试剂

1.5常用缓冲液的配制

1.6仪器

2方法

2.1间接ELISA(I-ELISA)方法筛选CymMV和ORSV病叶

2.2病毒的接种

2.3病毒提纯

2.4病毒浓度测定

2.5病毒外壳蛋白分析

2.6 I-ELISA测定提纯病毒

2.7电镜观察

3结果

3.1病毒分离和生物学鉴定结果

3.2病毒浓度及其理化性质

3.3病毒外壳蛋白分析

3.4 I-ELISA测定提纯病毒

3.5病毒形态学观察

4讨论

第三章建兰花叶病毒单克隆抗体制备及其检测应用

1材料

1.1病毒、培养基和抗血清

1.2常用生化试剂

1.3常用缓冲液的配制

2方法

2.1植物病毒接种及纯化、浓度测定

2.2单克隆抗体的制备及检测方法

2.3 Western-blot分析

2.4 ACP-ELISA检测CymMV的方法

2.5单克隆抗体的特异性检测

2.6检测灵敏度测定

2.7 ACP-ELISA方法田间检测CymMV的应用

3结果

3.1病毒提纯

3.2小鼠免疫

3.3杂交瘤细胞的融合、筛选、克隆

3.4腹水抗体制备和效价测定

3.5单克隆抗体的亚类型鉴定

3.6单克隆抗体对不同植物病毒的特异性测定

3.7检测灵敏度测定

3.8 Western-blot分析

3.9 ACP-ELISA的田间检测应用

4讨论

参考文献

附录

硕士期间形成的论文