金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达和生物活性研究以及基因组DNA固定化研究

摘要

1989年，瑞典科学家White J提出超抗原的概念，它是一类由细菌、病毒、寄生虫产生的对淋巴细胞具有强大刺激功能的蛋白质，由于其对T淋巴细胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故称为超抗原。金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是目前全世界范围内广泛研究的一种典型的超抗原。 与普通抗原不同，肠毒素超抗原首先以完整分子结合于抗原提呈细胞(APc)表面的II类主要组织相容性复合体(MHC)的抗原结合沟槽外侧，而后与T细胞表面的抗原受体分子(TCR)的Vβ区结合，形成SE-MHC-TCR三分子复合物后大量激活T细胞。由此激活的T细胞可直接杀伤表达MHC-II类分子的肿瘤细胞，而对不表达MHC-II类分子的肿瘤细胞也可产生间接的杀伤效应。 目前已发现的SEs约有20余种，包括：SEA～SEE、SEG～SEQ及TSST-l等。其中研究最为深入的主要包括A型金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxinA，SEA)、B型金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin B，SEB)、C2型金黄色萄萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin C2，SEC2)等，而对其它分型的肠毒素研究较少。E型金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxin E，SEE)作为一新型肠毒素，具有较好的热稳定性和较低的免疫原性，存在进行进一步研究的价值。 为了获得高纯度的SEE蛋白，研究其抗肿瘤活性，本研究试图通过基因工程手段大量表达重组蛋白。从天然产SEE的S.aureus (FRI 326)中扩增得到see基因，克隆至E. coli中大量表达重组SEE(recombinant SEE，rSEE)，通过亲和层析和阴离子交换层析得到纯度高于85％的rSEE，该重组蛋白仅在N端比nsEE多两个氨基酸残基(亮氨酸-谷氨酸，LeuGlu)。MTT法分析rSEE对T淋巴细胞的增殖作用和体外抗肿瘤效果，结果表明rSEE具有典型的超抗原活性。具超抗原活性的高纯度rSEE，为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制，构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。 本课题运用基因工程手段获得了纯度为85％的重组肠毒素rSEE，为制备该蛋白的单克隆和多克隆抗体奠定了基础;MTT法结果表明rSEE具有典型的超抗原活性：低浓度下引起T细胞大量增殖，通过激活T细胞产生显著的体外抗肿瘤效果，为深入研究SEE抗肿瘤原理，靶向抗肿瘤融合蛋白的构建以及肠毒素系列蛋白的平行比较研究打下物质基础。 在本次研究中，我们使用了水凝胶作为固相支持载体，选择了合适的化学固定方法，首次实现了对人基因组DNA的固定和反复使用。首先我们将末端修饰的PCR产物固定到凝胶上，检测了该法的固定效率以及热稳定性。通过改变反应条件，我们尝试用这一策略固定质粒碎片以及基因组DNA碎片，并作为模板DNA用于随后的PCR扩增反应中。该法固定DNA的效率高，热稳定性好，固定特异性高，同时固定载体具有良好的亲水性，便于随后的分子杂交以及PCR反应的进行。初步结论表明了这一方法的可行性，为将来的全基因组测序以及SNP检测打下了物质基础，并为系统的个体基因组自身比对分析提供了技术支持。

目录

论文说明:论文缩略词表

第一章金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达和生物活性研究

前言

实验材料与试剂

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二章基因组DNA固定化研究

前言

实验材料与试剂

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

综述 个体DNA资料库--基因组自身比对研究之基石

学习期间发表论文情况

致谢