奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌毒力因子的克隆表达及生物活性研究

摘要

本实验对奶牛乳腺炎阳性和阴性乳汁进行细菌分离培养计数和生化鉴定，对分离到的病原菌做药物敏感性试验。试验中分离出的细菌主要是葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、棒状杆菌和酵母菌。经过生化鉴定，乳腺炎阳性乳分离得到的细菌大多数是明显溶血的，凝固酶反应呈阳性的强致病菌，细菌计数也高于乳腺炎阴性组，差异极显著；而乳腺炎阴性乳中所分离得到的细菌大多是环境中条件性致病菌，致病性不强。 为建立奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌致病菌株的检测方法，依据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因序列，设计合成特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增Nuc基因，并将扩增基因克隆入T载体，进行序列测定，对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定。结果显示：金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带，大小为694bp；其他菌株未出现条带。敏感性检测的最低浓度为1.25×10<'3>cfu/mL。 血浆凝固酶是检验致病性金黄色葡萄球菌的重要指标，它们能使含有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固，有助于致病菌抵御宿主体内吞噬细胞和杀菌物质的作用。依据金黄色葡萄球菌血浆凝固酶基因序列，设计合成特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增其基因，并将扩增基因克隆入T载体，进行序列测定，对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定。结果显示：金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带，大小为761bp；其他菌株未出现条带。 金黄色葡萄球菌溶血素是一种外毒素，是其主要毒力因子之一，包括α、β、γ和6毒素。溶血素对多种哺乳动物红细胞有溶血作用，并可作用于平滑肌细胞，引起乳腺平滑肌收缩、麻痹，引发牛的坏疽性乳腺炎。本试验设计双重PCR方法，检测山东省内20多个规模化奶牛场乳腺炎病例中分离得到的金黄色葡萄球菌，试验发现：80％以上的金葡菌存在Q溶血素基因，基因片断长～704bp；而β溶血素基因比例为59％，片断大小为496bp。 检测金黄色葡萄球菌粘附素基因Fnbp A和Fnbp B，分析奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株纤连蛋白连接蛋白主效基因。利用设计合成的特异性引物对金黄色葡萄球菌进行PCR扩增，对本实验室所分离鉴定的金葡菌临床分离株进行双重PCR检测。PCR产物经过电泳成像显示，分别在524bp和642bp处出现特异性条带。通过对会葡菌临床分离株双重PCR检测发现：95％以上的金葡菌存在粘附素基因Fnbp A，而Fnbp B基因仅有10％。 检测金黄色葡萄球菌粘附素基因clfA和clf B，分析奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株聚集因子主效基因。利用设计合成的特异性引物对金黄色葡萄球菌进行PCR扩增，然后对本实验室所分离鉴定的金葡菌临床分离株进行双重PCR检测。PCR产物经过电泳成像显示，分别在292bp和205bp处出现特异性条带。通过对金葡菌临床分离株双重PCR检测发现：90％以上的金葡菌存在粘附素基因clfA，而clfB基因仅有40％。为克隆和表达奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌Fnbp A功能基因，采集奶牛急性乳腺炎乳样，分离金黄色葡萄球菌，提取DNA作为模板，利用设计合成的特异性引物，对金黄色葡萄球菌进行Fnbp A功能基因的PCR扩增。将目的基因回收并连接到T载体，鉴定后进行了测序，然后将Fnbp A基因连接到pET-32a(+)质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况。PCR产物经电泳成像，仅金黄色葡萄球菌在1.7kb处出现特异性条带，测序发现其与GenBank公布的Fnbp A序列的同源性为98％；蛋白诱导表达SDS-PAGE分析发现，在80ku处出现特异性条带。本试验成功地克隆到Fnbp A基因，并在大肠杆菌中获得高效表达，蛋白量为33.4％。细菌粘附阻止试验发现，蛋白可阻止73.24％的金黄色葡萄球菌粘附到哺乳动物细胞。试验中发现一种急性毒素性坏疽奶牛乳腺炎，怀疑α-HL是其致病因素，采集奶牛急性乳腺炎乳样，分离金黄色葡萄球菌，提取DNA作为模板，利用设计合成的特异性引物，对金黄色葡萄球菌进行α-HL基因的PCR扩增。将目的基因回收并连接到T载体，鉴定后进行了测序，然后将α-HL基因连接到pET-32a.(+)质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，工PTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况。PCR产物经电泳成像，仅金黄色葡萄球菌在893bp处出现特异性条带，测序发现其与GenBank公布的α-HL序列的同源性为100％：蛋白诱导表达SDS-PAGE分析发现，在53ktj处出现特异性条带，蛋白量为34％。重组蛋白活性检测发现：蛋白可引起注射部位明显溶血和坏死，兔红细胞溶血试验表明其溶血效价可达到2.26×10<'4>HU/mg。 根据金黄色葡萄球菌clfA基因，设计合成特异性引物，以国内奶牛乳腺炎临床分离株金黄色葡萄球菌基因组为PCR模板，进行clfA基因的克隆，并连接入pMD18-T载体进行测序和序列分析，然后经BamH I和Xba I双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1-ClfA，并进行鉴定。以金黄色葡萄球菌标准株为对照，国内分离株多数在990bp处扩增到特异性条带，经测序鉴定，与GerlBailk发表的会葡菌clfA序列同源性为99％：构建的真核表达质粒通过PCR和双酶切鉴定证明构建成功，为研究核酸疫苗奠定基础。 金黄色葡萄球菌Fnbp的抗体不仅可以阻止细菌的黏附，而且还是一种调理素，可以促进机体对细菌的清除作用。金黄色葡萄球菌的α-溶血素是一种胞外毒素，其类毒素对金黄色葡萄球菌所致的羊乳腺炎有部分保护作用。本试验利用获得的基因工程蛋白rFnbp、rα-HL及真核表达质粒pcDNA3.1<'+>-ClfA，混合佐剂免疫试验小鼠，通过ELISA方法检测血清中的抗体水平。结果发现：所有蛋白疫苗免疫试验小白鼠在首免后所采集的血清中均检测到了特异性抗体，通过初步金黄色葡萄球菌攻毒试验，证实制成的基因工程蛋白亚单位疫苗能使小鼠对金葡菌的感染率和死亡率降低，为金黄色葡萄球菌的防治提供一条新途径。

目录

论文说明：符号说明

声明

前言

1.奶牛乳腺炎的危害

2.诱发乳腺炎的病原菌

3.乳腺的防御系统

4.细菌感染乳腺的病理过程

5.乳房内细菌持续存在的机制

6.乳腺炎的症状和类别

7.乳腺炎的诊断

8.乳腺炎的治疗研究现状

9.乳腺炎的疫苗预防研究

9.1大肠杆菌疫苗

9.2链球菌疫苗

9.3金黄色葡萄球菌疫苗

10.金黄色葡萄球菌的生物学特性

试验基本材料和方法

1.基本材料

2.主要试验仪器

3.基本试验方法

试验部分

一、奶牛乳腺炎相关病原菌的分离与鉴定

试验1奶牛乳腺炎病原学比较研究

二、金黄色葡萄球菌相关毒力因子的PCR检测与分析

试验2 PCR扩增Nuc基因检测奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌

试验3 PCR扩增血浆凝固酶基因检测致病性金黄色葡萄球菌

试验4双重PCR检测金黄色葡萄球菌α和β溶血毒素基因

试验5双重PCR检测金黄色葡萄球菌粘附素Fnbp A和Fnbp B基因

试验6双重PCR检测金黄色葡萄球菌粘附素ClfA和ClfB基因

三、金葡菌毒力因子原核表达与活性检测及真核表达质粒构建

试验7金黄色葡萄球菌Fnbp A功能基因的克隆表达和活性检测

试验8金黄色葡萄球菌α溶血素的原核表达及其生物活性分析

试验9金黄色葡萄球菌(ClfA)功能基因的克隆和真核表达质粒的构建

四、金黄色葡萄球菌毒力因子免疫原性试验

试验10金黄色葡萄球菌基因工程疫苗免疫试验

结论

创新之处

参考文献

致谢

攻读学位期间发表相关论文情况

附录