氨苄西林酶促合成方法与介质体系研究

摘要

氨苄西林是一种常用的广谱β-内酰胺抗生素,目前主要采用化学法合成,反应条件苛刻,需要繁琐的保护与去保护步骤,对环境的污染较大。酶促合成方法可以显著减少反应步骤,反应条件温和,且产品杂质含量低,是清洁生产β-内酰胺抗生素的重要途径之一。 论文主要探索建立了完全有机介质中酶促合成氨苄西林的方法,研究了水-正己烷两相体系以及酶促一锅合成氨苄西林的新方法；扩展了有机溶剂添加的水相介质体系中酶促合成氨苄西林的研究内容。 论文在水相介质体系中,以D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(D-PGM·HCl)作为活性酰基供体,在pH调节的条件下与6-APA酶促反应合成氨苄西林。考察了国产固定化青霉素酰化酶IPA-750的催化性能,研究了酶浓度、pH值、底物浓度与比例、添加剂等对酶促反应的影响,最优化的结果为65.6％的产率和1.41的S/H比值。 论文通过使用D-苯甘氨酸甲酯(D-PGM)代替D-PGM-HCl作为酰基供体,成功地实现了完全有机介质中氨苄西林的酶促高效合成。论文筛选了一系列不同极性的有机溶剂,结果表明极性较弱的溶剂有利于保持IPA的活性,其中乙酸乙酯的效果最佳。考察了底物初始浓度、底物摩尔比、酶浓度、反应温度和酶的含水量对纯乙酸乙酯介质中酶促合成氨苄西林的影响,在最优化的条件下,实现了高浓度底物(300 mM 6-APA与600 mM D-PGM)时的高产率(92.9％)和高S/H值(1.50)的氨苄西林酶促合成反应。进一步的研究发现在乙酸乙酯中加入正己烷使IPA的合成和水解活性都得到了提高,但是更有利于D-PGM的水解反应。 论文研究了水-正己烷两相体系,发现30/70(v/v)的水-正己烷体系能够有效地抑制D-PGM的水解,提高6-APA和D-PGM的转化率,而且反应速度很快。在200 mM 6-APA和400 mM D-PGM的底物浓度条件下,25℃时只需反应2 h,即可达到90.5％的高产率和2.14的高S/H值。 论文研究建立了酶促一锅合成氨苄西林的方法。利用青霉素酰化酶能够催化酰化和水解两种反应的性质,先催化水解青霉素G钾盐产生抗生素母核6-APA,再催化6-APA与D-PGM发生酰化反应生成氨苄西林,节省了提纯6-APA的中间步骤,实现了直接从原料青霉素G钾盐得到产品氨苄西林的过程。在此基础上,将水-正己烷两相体系应用于酶促一锅法合成,进一步抑制了D-PGM的水解,促进了合成反应,最终氨苄西林产率和S/H比值分别达到了70.2％和1.09。

目录

文摘

英文文摘

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第一章 绪 论

第二章 β-内酰胺抗生素的酶促合成研究进展

2.1 引言

2.2 青霉素酰化酶及其固定化方法

2.3 β-内酰胺抗生素酶促合成反应的两大策略

2.3.1 热力学控制策略

2.3.2 动力学控制策略

2.4 反应介质体系的研究与发展

2.4.1 水-有机混合体系

2.4.2 水两相体系

2.4.3 冰相介质体系

2.4.4 固相介质体系

2.4.5 无溶剂体系

2.5 反应物浓度对β-内酰胺抗生素酶促合成的影响

2.5.1 水溶液-悬浊物体系

2.5.2 过饱和溶液体系

2.5.3 悬浊液-悬浊液体系

2.6 其它合成方法的发展

2.6.1 原位产物排出法

2.6.2 酶促一锅合成法

2.7小结

参考文献

第三章 水相介质中氨苄西林的酶促合成

3.1 引言

3.2实验部分

3.2.1 实验仪器与试剂

3.2.2 D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐的制备

3.2.3 水相介质中氨苄西林的酶促合成

3.2.4 薄层色谱检测

3.2.5 HPLC检测

3.3 水相介质中酶促合成氨苄西林的条件优化

3.3.1 酶浓度对酶促合成的影响

3.3.2 pH值对酶促合成的影响

3.3.3 底物浓度与比例对酶促合成的影响

3.4 添加剂对水相介质中酶促合成氨苄西林的影响

3.4.1 添加有机溶剂对酶促反应的影响

3.4.2 添加离子液体对酶促反应的影响

3.5 小结

参考文献

第四章 有机介质中氨苄西林的酶促合成

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 实验仪器与试剂

4.2.2 D-苯甘氨酸甲酯的制备

4.2.3 有机介质中氨苄西林的酶促合成

4.2.4 HPLC检测

4.3 有机介质中酶促合成氨苄西林的条件优化

4.3.1 有机溶剂的筛选

4.3.2 底物初始浓度对酶促合成的影响

4.3.3 底物摩尔比对酶促合成的影响

4.3.4 酶浓度对酶促合成的影响

4.3.5 温度对酶促合成的影响

4.3.6 酶的含水量对酶促合成的影响

4.3.7 乙酸乙酯中酶促合成氨苄西林的最优化条件

4.4 乙酸乙酯-甲醇混溶体系中氨苄西林的酶促合成

4.4.1 甲醇对酶促合成的影响

4.4.2 甲醇水溶液对酶促合成的影响

4.5 乙酸乙酯-正己烷混溶体系中氨苄西林的酶促合成

4.5.1 溶剂比例对酶促合成的影响

4.5.2 酶浓度对酶促合成的影响

4.5.3 温度对酶促合成的影响

4.6 小 结

参考文献

第五章 氨苄西林的酶促一锅法合成

5.1 引言

5.2实验部分

5.2.1 实验仪器与试剂

5.2.2 反应与检测

5.3 青霉素G钾盐的水解

5.3.1 酶活力的测定

5.3.2 pH值对PGK水解的影响

5.4 水相介质体系中氨苄西林的酶促一锅法合成

5.4.1 pH 8.0时的酶促一锅法合成

5.4.2 pH值对酶促一锅法合成的影响

5.5 水-正己烷两相体系中氨苄西林的酶促合成

5.5.1 两相溶剂比例对酶促合成的影响

5.5.2 底物在水-正己烷两相体系中的分配

5.5.3 酶浓度对酶促合成的影响

5.5.4 温度对酶促合成的影响

5.6 水-正己烷两相体系中氨苄西林的酶促一锅法合成

5.6.1 两相溶剂比例对酶促一锅法合成的影响

5.6.2 酶浓度对酶促一锅法合成的影响

5.6.3 两相体系中酶促一锅法合成氨苄西林的时间曲线

5.7 小结

第六章 总结与展望

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢