辣根过氧化物酶新型电极的构筑与自组装研究

摘要

辣根过氧化物酶(HRP)电极广泛运用于分析过氧化氢、有机过氧化物、酚类化合物、芳香化合物以及一些环境污染物，在化学分析、生物分析、医药、环境等领域中具有广泛的应用前景。论文研究生物亲和识别组装方法构筑HRP/ConA多层膜和HRP/GOD双酶多层膜，静电组装方法构筑聚电解质/染料/酶多层膜、及共价组装方法构筑硫醇/HRP膜，并研究了HRP组装过程的特点规律；制备了基于HRP/ConA多层膜的HRP电极、PSS—阳离子染料/HRP无试剂HRP电极、直接电子传递的HRP电极和HRP/GOD双酶电极，系统地评价了各类HRP电极性能。
　　 论文通过伴刀豆球蛋白(ConA)与辣根过氧化物酶亲和识别逐层组装制备了HRP/ConA多层膜，用原子力显微镜(AFM)、紫外光谱及Worthington活性测定等方法研究了ConA与HRP逐层组装过程的表面形貌、酶分子取向、组装量及活性等变化规律。ConA/HRP多层膜的酶活性随组装层数的增加线性增大，酶活性受离子强度、pH和组装时间等条件的影响；自组装膜表面酶分子的高度均一，膜厚度与酶分子XRD数据一致，能实现酶分子的定向组装。基于HRP/ConA多层膜制备的新型HRP电极，线性范围为0.8—3.0mmol·L—1，灵敏度达到10.84μA·mmol—1·L，具有稳定性好、灵敏度高等特点。
　　 论文研究了单电荷阳离子染料亚甲基蓝(MB)和耐尔蓝(NB)与聚电解质和酶组装构筑聚电解质/染料/酶多层膜；主要用聚苯乙烯磺酸钠(PSS)与单电荷阳离子染料复合为阴离子聚电解质，与诱导带正电荷HRP进行静电交替组装，并用循环伏安法(CV)、紫外光谱等方法研究聚电解质/染料/酶多层膜，详细考察了PSS与染料的比例、盐度及组装层数的影响；构筑了新型无试剂HRP电极。研究结果表明，(PSS—MB/HRP)4电极测定H2O2的线性范围为0.33—8.82mmol·L—1，灵敏度为2.04μA·mmol—1·L；(PSS—NB/HRP)2电极的线性范围为0.20—7.03mmol·L—1，灵敏度为8.45μA·mmol—1·L；抗坏血酸和葡萄糖等组分对该电极无干扰。PSS—阳离子染料/HRP复合膜中PSS及染料的组装量可控，而且聚电解质/染料/酶多层膜具有很好的稳定性。
　　 论文研究了葡萄糖氧化酶(GOD)和HRP/GOD双酶逐层组装膜的表面形貌、组装膜活性、GOD组装量等随组装过程的变化特点，分析了GOD电极测定葡萄糖的性能和HRP/GOD双酶电极测定酚类和芳香胺类化合物的性能。GOD逐层自组装膜和HRP/GOD双酶逐层自组装膜酶分子排列均匀，分子组装过程破坏作用小，有利于保留酶的活性。GOD逐层自组装膜电极，可检测溶液中的葡萄糖，其活性受pH值和组装层数的影响，在pH7.0条件下，组装4层GOD的电极具有最大的灵敏度0.915μA·mmol—1·L、线性范围(0.55—6.63 mol·L—1)和米氏常数11.43mmol·L—1。HRP/GOD双酶电极对儿茶酚和对苯二胺的响应灵敏度分别为76.82μA·mmol—1·L和131.59mA·μmol—1·L，线性范围分别为6.0—60.0μmol·L—1和7.6—68.4μmol·L—1。测定芳香胺类物质和酚类物质的灵敏度与取代基的给电子共轭效应是一致的，即取代基的共轭给电子效应越大，灵敏度越高。
　　 论文研究发展了在金电极表面共价组装固定HRP方法，用循环伏安法(CV)、电化学阻抗谱(EIS)和拉曼光谱(Raman)等方法研究了HRP在硫醇自组装膜改性金电极上的直接电子传递的影响因素，制备了直接电子传递的HRP电极，并评价了基于直接电子传递HRP电极测定H2O2的性能。HRF与硫醇自组装膜改性的金电极之间的直接电子传递受硫醇结构、pH和组装时间的影响，在半胱胺、3—巯基丙酸(MPA)和对巯基苯胺三种硫醇自组装膜上，MPA自组装膜最有利于HRP直接电子传递。基于直接电子传递的Au/MPA/HRP电极可以实现对H2O2响应时间小于3s的快速检测，线性范围为0.17—2.3mmol·L—1，灵敏度为8.51μA·mmol—1·L，表观米氏常数(Km)为5.7mmol·L—1。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

第二章 酶生物传感器及其活性膜自组装构筑研究进展

2.1酶与电子媒介体逐层组装的无试剂生物传感器

2.2酶的直接电子传递与第三代生物传感器

2.3生物传感器活性膜的自组装制备技术

2.4生物分子自组装膜的表征技术

2.5辣根过氧化物酶电极的研究现状

参考文献

第三章 糖蛋白-凝集素亲和识别自组装构筑HRP传感器

3.1实验部分

3.2 Con A/HRP亲和识别自组装膜的制备

3.2.1 ConA/HRP亲和识别组装HRP多层膜的原理

3.2.2 ConA/HRP亲和识别自组装膜的制备

3.3组装条件对Con A/HRP自组装膜活性的影响

3.3.1组装时间对Con A/HRP自组装膜活性的影响

3.3.2离子强度对Con A/HRP自组装膜活性的影响

3.3.3组装液pH对Con A/HRP自组装膜活性的影响

3.3.4组装温度对自组装膜活性的影响

3.4 Con A/HRP自组装膜的稳定性

3.4.1 Con A/HRP自组装膜的pH稳定性

3.4.2 Con A/HRP自组装膜的热稳定性

3.4.3 Con A/HRP自组装膜的时间稳定性

3.5 Con A/HRP自组装膜电极的性能

3.5.1 Con A/HRP自组装膜电极测定H2O2的机理

3.5.2 Con A/HRP自组装膜电极在亚甲基蓝溶液中的电化学行为

3.5.3 Con A/HRP自组装膜电极对H2O2的响应

3.5.4 Con A/HRP自组装膜电极测定H2O2的灵敏度和线性范围

3.6小结

参考文献

第四章 PSS-阳离子染料/HRP构筑无试剂HRP传感器

4.1实验部分

4.2 PSS-阳离子染料/HRP多层膜的组装

4.2.1 PSS-MB/HRP多层膜的组装

4.2.2 PSS-NB/HRP多层膜的组装

4.3组装条件对PSS-阳离子染料/HRP电极的影响

4.3.1离子强度对PSS-阳离子染料/HRP电极的影响

4.3.2 PSS/阳离子染料比例对HRP电极的影响

4.3.3组装层数对PSS-阳离子染料/HRP电极的影响

4.4 PSS-阳离子染料/HRP电极测定H2O2的性能

4.4.1 (PSS-阳离子染料/HRP)n电极阳离子染料的电化学特征

4.4.2 (PSS-阳离子染料/HRP)n电极对H2O2的电化学响应

4.4.3 (PSS-阳离子染料/HRP)n电极测定H2O2的灵敏度和线性范围

4.4.4 (PSS-阳离子染料/HRP)n电极测定H2O2的抗干扰性

4.4.5 (PSS-阳离子染料/HRP)n电极的稳定性

4.5小结

参考文献

第五章 自组装构筑直接电子传递的HRP传感器

5.1实验部分

5.2硫醇/HRP自组装膜的制备

5.2.1硫醇自组装膜的结构

5.2.2 HRP与硫醇的相互作用分析

5.2.3 HRP自组装膜的电化学阻抗谱

5.3 HRP/硫醇组装膜的直接电子传递

5.3.1 HRP在不同自组装膜表面的直接电子传递

5.3.2 HRP在MPA自组装膜表面的直接电子传递

5.3.3 组装时间和pH对HRP直接电子传递的影响

5.4直接电子传递的HRP传感器性能

5.4.1 HRP自组装膜电极对H2O2的电化学响应

5.4.2 HRP/MPA/Au电极检测H2O2的线性范围和灵敏度

5.5小结

参考文献

第六章 HRP/GOD双酶逐层自组装构筑HRP传感器

6.1实验部分

6.2葡萄糖氧化酶LBL自组装膜的制备

6.2.1 GOD自组装膜的表面形貌

6.2.2 GOD组装量随组装时间的变化

6.2.3 GOD组装量随组装层数的变化

6.2.4 GOD自组装多层膜的活性

6.3 葡萄糖氧化酶传感器性能研究

6.3.1 甲酸二茂铁催化葡萄糖氧化酶电极的工作原理

6.3.2 GOD自组装膜电极对葡萄糖的响应

6.3.3 GOD自组装膜电极的响应性能

6.4 HRP/GOD多层膜电极的制备

6.4.1 HRP/GOD多层组装膜的形貌

6.4.2 HRP组装层数对HRP/GOD电极灵敏度的影响

6.4.3 葡萄糖浓度对双酶电极电流响应的影响

6.5 HRP/GOD双酶传感器的性能研究

6.5.1 HRP/GOD双酶传感器测定儿茶酚和对苯二胺的性能

6.5.2 HRP/GOD双酶传感器的抗干扰性

6.5.3 HRP/GOD双酶传感器对不同酚类和不同芳香胺的测定

6.6小结

参考文献

第七章 总结

攻读博士学位期间发表的论文

致谢