白菜花粉发育相关的PGIP新基因BcMF19的克隆与表达分析

摘要

尽管利用农作物杂种优势生产杂交种子的途径很多,但以利用雄性不育性育成不育系生产杂种是最为经济、有效的途经。芸薹属作物作为杂交优势利用最为普遍的一类作物,创建雄性不育系是生产一代杂种的理想方法。花粉发育相关基因的分离和基因功能分析,为深入探索白菜类等芸薹属作物花粉发育的分子机制提供了实验依据,也同样能通过运用反义或者干涉技术等抑制花粉发育相关基因的表达而获得雄性不育植株,进而用于生产。但是,有效地控制育性的基础还在于对花粉发育相关的一系列基因及其功能的充分认识。本研究的依据是白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)核隐性不育两用系‘Bcajh97-01A/B’中分离得到一个在不育和可育株花蕾中差异表达的扩增互补脱氧核糖核酸片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)片段,NCBI的比对结果发现,该片段具有多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibitory protein,PGIP)基因的特征。为了认识该片段基因的结构和表达特征,为进一步研究其功能打下基础,本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术和同源基因扩增的方法克隆基因全长,分析其序列特征并预测其蛋白质结构和功能,进而采用实时定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)分析其在可育株和不育株的不同发育阶段的花蕾中和营养器官中的表达情况,采用组织原位杂交进行该基因的细胞定位,预测其与花粉发育的关系。取得的主要结果如下:(1)从白菜核隐性不育两用系‘Bcajh97-01A/B’可育株中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段入手,利用RACE技术和同源基因扩增的方法成功克隆出一条在正常可育株花蕾中高表达的PGIP基因的cDNA全长,命名为白菜雄性可育基因19(Brassica campestris Male Fertility19,BcMF19),该序列已被递交到GeneBank数据库,登录号为:GQ902048。用同源克隆的方法得到1136碱基对(base pair,bp)的BcMF19的DNA全长序列。BcMF19包含两个外显子(605 bp和373 bp)和一个内含子(158 bp),外显子和内含子交接处序列遵循GT-AG规律,是典型的剪接体识别序列。该基因的最大开放阅读框(Openreadinz frame,ORF)为978 bp,编码325个氨基酸。BcMF19二级结构包含27.38％的α螺旋,15.08%的β折叠和57.54%的环状结构,并含有一个保守的疏水区和一个跨膜螺旋区,而且该蛋白包含10个富亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat,LRR),1个信号肽和3个N-糖基化位点,N端和C端分别有半胱氨酸的二硫键形成区,与PGIP的典型二级结构一致。BcMF19的三级结构是一个β-片层(LxxLxLxxN/CxL)和一个α-螺旋通过loop环连接形成,相邻的多个LRR通常围绕共同的轴平行排列,形成一个卷曲的马蹄形结构,与PGIP的典型三级结构一致。这些结果表明BcMF19具有PGIP的基本特征,可能属于PGIP家族中的一员。(2)使用DNAStar软件中的MegAlign程序,对十字花科芸薹属和萝卜属17份材料的BcMF19同源基因DNA序列进行核苷酸同源序列比对,发现BcMF19同源基因在DNA序列上的相似性为97.3%~100%,这说明不同物种中BcMF19同源基因保守,分化后碱基的替代事件发生较少。芸薹属中的普通白菜与“大头1”芜菁甘蓝、黑芥与“雪里蕻”分蘖菜和普通白菜与“马耳头”分蘖菜DNA的相似性都达到了99.9%。但是其中埃塞俄比亚芥与“黄芽14”大白菜的DNA相似性最低,为97.3%。而黑芥和樱叶萝卜的DNA的相似度达到100%。BcMF19与其他物种的48个PGIP比对发现,其N末端除了半胱氨酸残基部分与十字花科相似性较高,其他部分就存在一定的差异,并且BcMF19与其他十字花科PGIP的LRR的保守区一致,但非保守序列几乎没有相似性。NJ法构建的进化树结果为BcMF19与十字花科植物的PGIP不聚为一类,推测BcMF19是十字花科PGIP基因在进化中的又一分支。(3)实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和原位杂交技术分析BcMF19的时空表达表明,该基因在可育株五级花蕾中的表达量是明显上调的,尤其在花粉减数分裂期、四分体时期和成熟花粉粒时期,说明BcMF19与花粉发育相关。而且该基因在可育株和不育株的花茎和花叶中表达量也有略微差异,表明其不是花粉发育特异基因,它同时参与了营养生长阶段,虽然可育株中基因表达量高于不育株,但是这样相对量的差异并不足以阻碍营养器官的正常发育。(4)该基因定位于绒毡层和小孢子上,推测该基因会影响绒毡层的发育从而阻碍花粉壁的形成。并且该基因在成熟花粉里时期的胚囊中有所表达,原因是雄性发育器官表达的基因在胚胎中再次出现还是父本基因印迹还需要进一步的研究。

目录

致谢

缩写词

摘要

Abstract

0 引言

1 文献综述

1.1 花粉壁的发育

1.1.1 花药绒毡层与花粉壁发育

1.2 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的相关研究

1.2.1 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的结构

1.2.2 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白与多聚半乳糖醛酸酶的相互作用

1.2.3 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的功能

2 白菜花粉发育相关基因BcMF19的克隆及序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 植物材料与主要试剂

2.1.2 DNA提取

2.1.3 RNA分离及检测

2.1.4 cDNA的合成

2.1.5 PCR扩增基因全长

2.1.6 大肠杆菌感受态的制备

2.1.7 cDNA和DNA测序

2.1.8 序列的特征分析

2.2 结果与分析

2.2.1 RNA的提取与cDNA得合成

2.2.2 获得BcMF19 cDNA全长和DNA全长

2.2.3 BcMF19核苷酸序列

2.2.4 BcMF19的特征

2.3 讨论

2.3.1 BcMF19的结构

2.3.2 BcMF19的相关功能预测

3 十字花科植物BcMF19同源序列的克隆及系统进化分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 同源基因的克隆及测序

3.1.3 序列差异分析和系统进化分析

3.2 结果与分析

3.2.1 十字花科BcMF19同源基因序列的特征

3.2.2 十字花科BcMF19同源基因核苷酸序列相似性

3.2.3 BcMF19同源基因序列的遗传距离及进化关系

3.2.4 BcMF19与48个同源基因蛋白的相似性与进化分析

3.3 讨论

4 BcME19在‘Bcajh97-01A/B'可育株中的相对表达量分析

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实时定量PCR的引物设计

4.1.3 实时定量PCR的体系及程序

4.1.4 实时定量PCR的计算方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

5 BcMF19在‘Bcajh97-01A/B'可育株中的组织原位杂交分析

5.1 材料与方法

5.1.1 实验材料及药品

5.1.2 材料的固定、包埋和制片

5.1.3 RNA探针的地高辛标记

5.1.4 组织原位杂交

5.2 结果与分析

5.3 讨论

结论

参考文献

硕士期间发表的论文