大白菜抗根肿病新基因CRw紧密连锁的SNP分子标记及应用

摘要

本发明公开了一种大白菜抗根肿病新基因CRw紧密连锁的SNP分子标记及应用。本发明提供了双侧分子标记(BVRC‑A03033590标记和BVRC‑A03035160标记)。BVRC‑A03033590标记相应的SNP位点及其周边序列如序列表的序列4所示(SNP位点为序列4的第101位，命名为SNP位点甲，为T/A多态)。BVRC‑A03035160标记相应的SNP位点及其周边序列如序列表的序列8所示(SNP位点为序列8的第101位，命名为SNP位点乙，为T/A多态)。两个标记可以联合或者单独使用，用于大白菜抗根肿病分子标记辅助育种。本发明的应用将对加快大白菜抗根肿病育种进程起到重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大白菜抗根肿病新基因CRw紧密连锁的SNP分子标记及应用。

背景技术

十字花科蔬菜根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)侵染引起的一种世界性病害。根肿病最早发现于地中海沿岸(英国，1737)和欧洲南部(前苏联列宁格勒，1872)。我国自1955年首次发现根肿病以来，现已扩散至全国各地。

在根肿病抗病基因研究方面，国外很早就对芸薹种种质资源中的抗根肿病(CR)基因进行挖掘。目前报道的位于A03染色体的大白菜抗根肿病基因有5个，其中CRa是第一个被克隆的CR基因，该基因编码TIR-NBS-LRR(TNL)类蛋白，同时已开发出该基因的功能分子标记。Saito等(2006)将Crr3精细定位在A03连锁群BrSTS-33和BrSTS-78标记间0.35cM的区间内。Sakanoto等(2008)利用F2群体和STS标记，定位得到位于A03连锁群上的CRk新位点。朴钟云研究组先后在A03染色体上定位了CRb和CRd这2个CR基因。

分子标记在目标资源筛选，定位调控特定农艺性状的基因，基因聚合，品种鉴定等方面的应用越来越广泛。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC(Laboratory ofthe Government Chemist)有限公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点。该方案的核心是KASP技术，即Competitive Allele-Specific PCR。目前该项技术已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种大白菜抗根肿病新基因CRw紧密连锁的SNP分子标记及应用。

本发明提供了用于鉴定SNP位点甲的物质和/或用于鉴定SNP位点乙的应用，为如下(a)或(b)：(a)鉴定大白菜的根肿病抗性；(b)选育抗根肿病大白菜。

本发明还提供了一种鉴定大白菜的根肿病抗性的方法，为方法Ⅰ-1或方法Ⅰ-2。

方法Ⅰ-1包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点甲的基因型和基于SNP位点乙的基因型；如果供试大白菜基于SNP位点甲的基因型为TT纯合型且基于SNP位点乙的基因型为TT纯合型，供试大白菜为抗根肿病大白菜。

方法Ⅰ-2包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点甲携带的等位基因和基于SNP位点乙携带的等位基因；如果供试大白菜在SNP位点甲携带T等位基因且在SNP位点乙携带T等位基因，供试大白菜为抗根肿病大白菜。

本发明还提供了一种选育抗根肿病大白菜的方法，为方法Ⅰ-3或方法Ⅰ-4。

方法Ⅰ-3包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点甲的基因型和基于SNP位点乙的基因型；选择基于SNP位点甲的基因型为TT纯合型且基于SNP位点乙的基因型为TT纯合型的大白菜作为抗根肿病大白菜(可以作为目标植株，也可以作为下一步育种的亲本)。

方法Ⅰ-4包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点甲携带的等位基因和基于SNP位点乙携带的等位基因；选择在SNP位点甲携带T等位基因且在SNP位点乙携带T等位基因的大白菜作为抗根肿病大白菜(可以作为目标植株，也可以作为下一步育种的亲本)。

本发明还提供了一种鉴定大白菜的根肿病抗性的方法，为方法Ⅱ-1或方法Ⅱ-2。

方法Ⅱ-1：检测供试大白菜基于SNP位点甲的基因型；如果供试大白菜基于SNP位点甲的基因型为TT纯合型，供试大白菜为抗根肿病大白菜。

方法Ⅱ-2：检测供试大白菜基于SNP位点甲携带的等位基因；如果供试大白菜在SNP位点甲携带T等位基因，供试大白菜为抗根肿病大白菜。

本发明还提供了一种选育抗根肿病大白菜的方法，为方法Ⅱ-3或方法Ⅱ-4。

方法Ⅱ-3包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点甲的基因型；选择基于SNP位点甲的基因型为TT纯合型的大白菜作为抗根肿病大白菜(可以作为目标植株，也可以作为下一步育种的亲本)。

方法Ⅱ-4包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点甲携带的等位基因；选择在SNP位点甲携带T等位基因的大白菜作为抗根肿病大白菜(可以作为目标植株，也可以作为下一步育种的亲本)。

本发明还提供了一种鉴定大白菜的根肿病抗性的方法，为方法Ⅲ-1或方法Ⅲ-2。

方法Ⅲ-1包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点乙的基因型；如果供试大白菜基于SNP位点乙的基因型为TT纯合型，供试大白菜为抗根肿病大白菜。

方法Ⅲ-2包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点乙携带的等位基因；如果供试大白菜在SNP位点乙携带T等位基因，供试大白菜为抗根肿病大白菜。

本发明还提供了一种选育抗根肿病大白菜的方法，为方法Ⅲ-3或方法Ⅲ-4；

方法Ⅲ-3包括如下步骤：检测供试大白菜基SNP位点乙的基因型；选择基于SNP位点乙的基因型为TT纯合型的大白菜作为抗根肿病大白菜(可以作为目标植株，也可以作为下一步育种的亲本)。

方法Ⅲ-4包括如下步骤：检测供试大白菜基于SNP位点乙携带的等位基因；选择在SNP位点乙携带T等位基因的大白菜作为抗根肿病大白菜(可以作为目标植株，也可以作为下一步育种的亲本)。

用于鉴定SNP位点甲的物质具体可为特异引物组甲。

用于鉴定SNP位点乙的物质具体可为特异引物组乙。

检测供试大白菜基于SNP位点甲的基因型的实现方式具体可为：以供试大白菜的基因组DNA为模板，采用特异引物对扩增具有SNP位点甲的区域，然后进行测序。

检测供试大白菜基于SNP位点乙的基因型的实现方式具体可为：以供试大白菜的基因组DNA为模板，采用特异引物对扩增具有SNP位点乙的区域，然后进行测序。

检测供试大白菜基于SNP位点甲携带的等位基因的实现方式具体可为：以供试大白菜的基因组DNA为模板，采用特异引物对扩增具有SNP位点甲的区域，然后进行测序。

检测供试大白菜基于SNP位点乙携带的等位基因的实现方式具体可为：以供试大白菜的基因组DNA为模板，采用特异引物对扩增具有SNP位点乙的区域，然后进行测序。

检测供试大白菜基于SNP位点甲的基因型的实现方式具体可为：以供试大白菜的基因组DNA为模板，采用特异引物组甲进行竞争性等位基因特异性PCR。

检测供试大白菜基于SNP位点乙的基因型的实现方式具体可为：以供试大白菜的基因组DNA为模板，采用特异引物组乙进行竞争性等位基因特异性PCR。

检测供试大白菜基于SNP位点甲携带的等位基因的实现方式具体可为：以供试大白菜的基因组DNA为模板，采用特异引物组甲进行竞争性等位基因特异性PCR。

检测供试大白菜基于SNP位点乙携带的等位基因的实现方式具体可为：以供试大白菜的基因组DNA为模板，采用特异引物组乙进行竞争性等位基因特异性PCR。

以上任一所述SNP位点甲为大白菜基因组DNA中的序列表的序列4所示DNA分子中的第101位核苷酸，为T/A多态。

以上任一所述SNP位点乙为大白菜基因组DNA中的序列表的序列8所示DNA分子中的第101位核苷酸，为T/A多态。

本发明还保护一种引物组合，由特异引物组甲和特异引物组乙组成。

本发明还保护特异引物组甲或特异引物组乙。

特异引物组甲由序列表的序列1所示引物、序列表的序列2所示引物和序列表的序列3所示引物组成。

特异引物组乙由序列表的序列5所示引物，序列表的序列6所示引物和序列表的序列7所示引物组成。

本发明还保护所述引物组合或所述特异引物组甲或所述特异引物组乙的应用，为如下(a)或(b)：

(a)鉴定大白菜的根肿病抗性；

(b)选育抗根肿病大白菜。

以上任一所述大白菜可为以大白菜材料ST300为亲本得到的后代植株。

以上任一所述大白菜可为以大白菜材料ST300和大白菜材料ST237为亲本得到的后代植株。

以上任一所述大白菜可为：以大白菜材料ST300和大白菜材料ST237为亲本得到的F1植株的自交后代。

将基于SNP位点甲的基因型和基于SNP位点乙的基因型均为TT基因型的植株自交，可以得到抗根肿病大白菜品种或品系。

将基于SNP位点甲的基因型为TT基因型的植株自交，可以得到抗根肿病大白菜品种或品系。

将基于SNP位点乙的基因型均为TT基因型的植株自交，可以得到抗根肿病大白菜品种或品系。

以上任一所述抗根肿病大白菜接种根肿病菌后的病情分级为0级或1级。

以上任一所述根肿病具体可为芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)引起的根肿病。

以上任一所述根肿病具体可为根肿病菌4号生理小种引起的根肿病。

本发明的优点是分子标记(SNP位点)为共显性，鉴定结果准确可靠、省时省力、降低了劳动成本，本发明的应用将对加快大白菜抗根肿病育种进程起到重要作用。

附图说明

图1为不同基因在A03染色体的物理位置。

图2为基于BSA-Seq将CRw基因定位在A03染色体2.96Mb的区间内。

图3为基于SNP位点甲的基因型检测结果。

图4为基于SNP位点乙的基因型检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例中所用的根肿病菌为根肿病菌4号生理小种(湖北长阳火烧坪菌源)。文献：汪维红,余阳俊,丁云花,et al.湖北省长阳县十字花科蔬菜根肿病菌生理小种鉴定及抗源筛选[J].中国蔬菜,2013(12):55-60。

实施例1、F2代群体的制备

大白菜材料ST300(即文献中的Chinese cabbages JJ)：高抗根肿病。大白菜材料ST237(即文献中Supplementary Table S1中的NRBCS)：高感根肿病。文献：Tongbing S,Shuancang Y,Zhenping G,et al.Evaluating multiple resistance to major diseasesin a core set of inbred lines of Brassica rapa at seedling stage[J].Journalof Plant Pathology,2018.100:457–465。

大白菜材料ST300作为母本，大白菜材料ST237作为父本，进行杂交，获得F1代种子，F1代种子长成的植株即为F1代植株。F1代植株自交，得到F2代种子，F2代种子长成的植株即为F2代植株。

实施例2、抗病基因CRw的定位及分子标记开发

1、F2群体(由实施例2得到的305株F2代植株组成)，人工接种根肿病菌，发病后进行抗病分级，分别选取30株抗病级别为0级(高抗)和30株抗病级别为9级(高感)的单株构建R池和S池进行重测序。

2、CRw的定位及分子标记开发

采用SNP-index法将抗根肿病基因CRw定位在A03染色体2.96Mb的区间内，进一步在此区间内根据重测序获得的CRw基因双侧SNP位点并开发SNP分子标记，最终获得与CRw紧密连锁的双侧分子标记(BVRC-A03033590标记和BVRC-A03035160标记)。

用于鉴定BVRC-A03033590标记的引物组(命名为引物组甲)由如下三条引物组成：

BVRC-A03033590A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACAGAACTTCAGTAATAGATTTCCAGTT；

BVRC-A03033590A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAACAGAACTTCAGTAATAGATTTCCAGTA；

BVRC-A03033590C：GATGGTAGGTAGTAGTGGCTTTACATAAAA。

BVRC-A03033590标记相应的SNP位点及其周边序列如序列表的序列4所示(SNP位点为序列4的第101位)。该SNP位点命名为SNP位点甲，为T/A多态。SNP位点甲位于A03染色体的第16620661位。BVRC-A03033590A1如序列表的序列1所示。BVRC-A03033590A2如序列表的序列2所示。BVRC-A03033590C如序列表的序列3所示。

用于鉴定BVRC-A03035160标记的引物组(命名为引物组乙)由如下三条引物组成：

BVRC-A03035160A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCCCCAAAACCCACCAATTGCTA；

BVRC-A03035160A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCCCAAAACCCACCAATTGCTT；

BVRC-A03035160C：GAAACCCTAGAAATCTCGATTCGAAACTT。

BVRC-A03035160标记相应的SNP位点及其周边序列如序列表的序列8所示(SNP位点为序列8的第101位)。该SNP位点命名为SNP位点乙，为T/A多态。SNP位点乙位于A03染色体的第17359869位。BVRC-A03035160A1如序列表的序列5所示。BVRC-A03035160A2如序列表的序列6所示。BVRC-A03035160C如序列表的序列7所示。

3、CRw与前人报道CR基因的比较

迄今为止，在A03染色体上共有5个基因已经被报道，分别为CRa、CRb、Crr3、CRk和CRd。通过这些基因紧密连锁的分子标记在白菜基因组网站(http://brassicadb.org/brad/index.php)V3.0版比对后发现，CRk位于A03染色体15.33Mb的范围内，CRd位于A03染色体15.986-16.047Mb的区间内，Crr3位于A03染色体16.047-16.289Mb的区间内，CRb位于A03染色体24.82-24.905Mb的区间内，而CRa位于A03染色体25.54Mb处。本发明定位的CRw位于A03染色体16.621-17.36Mb的区间内，与上述已报道的基因均不相同，为新的基因。不同基因在A03染色体的物理位置见图1。基于BSA-Seq将CRw基因定位在A03染色体2.96Mb的区间内，见图2。

实施例3、BVRC-A03033590标记和BVRC-A03035160标记在鉴定大白菜根肿病抗性中的应用

供试植株：实施例2得到的90株F2代植株、大白菜材料ST300植株、大白菜材料ST237植株、实施例2得到的F1代植株。

一、鉴定供试植株的根肿病抗性

正常培养供试植株，人工接种根肿病菌，发病后调查病情。具体方法见参照文献：Tongbing S,Shuancang Y,Zhenping G,et al.Evaluating multiple resistance tomajor diseases in a core set of inbred lines of Brassica rapa at seedlingstage[J].Journal of Plant Pathology,2018.100:457–465。

病情分级标准如下：

0级：无病；

1级：侧根上有结节状的小根瘤，发病根占根系全部的1％-10％(不含10％)；

3级：侧根上有根瘤附着，发病根占根系全部的10％(含10％)-50％(不含50％)；

5级：主根根瘤较小，发病根占根系全部的50％(含50％)-80％(不含80％)；

7级：主根根瘤较大，发病根占根系全部的80％以上；

9级：主根根瘤大，呈纺锤形。

0级和1级，判断为抗根肿病，用R表示。

3级、5级、7级和9级，判断为感根肿病，用S表示。

45株大白菜材料ST300植株的病情指数为0.5。32株大白菜材料ST237植株的病情指数为88.9。44株F1代植株的病情指数为8.3。

90株F2代植株的根肿病抗性结果见表1。

二、鉴定供试植株的基因型

1、提取供试植株叶片的基因组DNA，用TE缓冲液稀释至4-10ng/μl，即为模板溶液。

基因组DNA的质控：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测，A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)，A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)，270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。

2、竞争性等位基因特异性PCR

按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程(基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程)进行。所用试剂除特殊说明外均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B。反应在1536微孔板中进行。

具体步骤：首先利用K-pette分液工作站将1.5μl模板溶液加入1536孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1μL反应体系，分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。

反应体系甲：10μM BVRC-A03033590A1溶液、10μM BVRC-A03033590A2溶液和10μMBVRC-A03033590C溶液，依次按照6:6:15体积比混匀，得到引物预混液；2×Master mix(货号为Part No.KBS-1016-011)、引物预混液和水依次按照36:1：36的体积比混匀。

反应体系乙：10μM BVRC-A03035160A1溶液、10μM BVRC-A03035160A2溶液和10μMBVRC-A03035160C溶液，依次按照6:6:15体积比混匀，得到引物预混液；2×Master mix(货号为Part No.KBS-1016-011)、引物预混液和水依次按照36:1：36的体积比混匀。

PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒、复性延伸1min(第一个循环为61℃，每个循环降低0.6℃，最后一个循环为55℃)；94℃变性20秒、55℃60秒，26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。

反应体系甲的结果见图3。图3中，红色代表AA基因型，蓝色代表TT基因型，绿色代表TA基因型。

反应体系乙的结果见图4。图3中，红色代表AA基因型，蓝色代表TT基因型，绿色代表AT基因型。

结果显示分型效果良好，引物组甲能有效鉴定供试植株基于SNP位点甲的基因型为TT基因型、AA基因型还是AT基因型，引物组乙能有效鉴定供试植株基于SNP位点乙的基因型为TT基因型、AA基因型还是AT基因型。

大白菜材料ST300植株基于SNP位点甲的基因型均为TT，基于SNP位点乙的基因型均为TT。大白菜材料ST237植株基于SNP位点甲的基因型均为AA，基于SNP位点乙的基因型均为AA。F1代植株基于SNP位点甲的基因型均为AT，基于SNP位点乙的基因型均为AT。

90株F2代植株基于SNP位点甲和基于SNP位点乙的基因型结果见表1。

三、基因型与性状的关联分析

表1

表1中，-表示未获得基因型分型结果。

基于SNP位点甲，47株植株携带T等位基因，其中17株为TT基因型，30株为AT基因型。基于SNP位点甲，如果将TT基因型的植株判断为抗病植株，准确率为88.2％(15/17)。基于SNP位点甲，如果携带等位基因T的植株判断为抗性植株，准确率为85.1％(40/47)。基于SNP位点甲，41株植株为AA基因型。基于SNP位点甲，如果将AA基因型的植株判断为感病植株，准确率为100％(41/41)。

基于SNP位点乙，47株植株携带T等位基因，其中19株为TT基因型，28株为AT基因型。基于SNP位点乙，如果将TT基因型的植株判断为抗病植株，准确率为89.5％(17/19)。基于SNP位点乙，如果携带等位基因T的植株判断为抗性植株，准确率为80.9％(38/47)。基于SNP位点乙，42株植株为AA基因型。基于SNP位点乙，如果将AA基因型的植株判断为感病植株，准确率为95.2％(40/42)。

基于SNP位点甲和SNP位点乙，43株植株两个位点同时携带T等位基因，其中16株两个位点均为TT基因型。基于SNP位点甲和SNP位点乙，如果将两个位点均为TT基因型的植株判断为抗病植株，准确率为93.8％(15/16)。基于SNP位点甲和SNP位点乙，如果将两个位点同时携带T等位基因的植株判断为抗性植株，准确率为83.7％(36/43)。基于SNP位点甲和SNP位点乙，38株植株两个位点均为AA基因型。基于SNP位点甲和SNP位点乙，如果将两个位点均为AA基因型的植株判断为感病植株，准确率为100％(38/38)。

以上结果表明，BVRC-A03033590标记和BVRC-A03035160标记可以联合或者单独使用，用于大白菜抗根肿病分子标记辅助育种。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市农林科学院

<120> 大白菜抗根肿病新基因CRw紧密连锁的SNP分子标记及应用

<130> GNCYX192438

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc taaacagaac ttcagtaata gatttccagt t 51

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat taaacagaac ttcagtaata gatttccagt a 51

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gatggtaggt agtagtggct ttacataaaa 30

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> Chinese cabbages

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> w is t or a

<400> 4

ttcttaaacc gggtattaaa atcattaatc ttatccttac actgctgaga ccaaacatga 60

taacctctct caaacagaac ttcagtaata gatttccagt wgctcttttt atgtaaagcc 120

actactacct accatccata ctagaatcat cacctatata agacacttgg gttatcaaca 180

acttcaccat cttatcagtc c 201

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc tgccccaaaa cccaccaatt gcta 44

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat tgccccaaaa cccaccaatt gctt 44

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gaaaccctag aaatctcgat tcgaaactt 29

<210> 8

<211> 201

<212> DNA

<213> Chinese cabbages

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> w is t or a

<400> 8

ttcagaagct tgaaggaaaa cccacgaaga ggggtttctg ttctccacag attcagatta 60

cgaaacccta gaaatctcga ttcgaaactt gacccgcgaa wagcaattgg tgggttttgg 120

ggctcggcgg tgaaacgata aaataacgga attagaacga gaaattggag aaaaaagaga 180

cgatctttgc ttccccctct c 201