酯酶的克隆、表达、筛选以及立体选择性的定向进化研究

摘要

酯酶(EC3.1.1.x)是能够催化一系列酯键生成相应的酸和醇的重要生物催化剂。其在有机溶剂中有较好的稳定性、活性及立体选择性，因此被广泛用于合成食品添加剂、农用化学品和医药中间体等重要化合物.在本课题中，我们采用分子克隆手段，从大肠杆菌K-12中克隆表达出一系列的酯酶并且研究其性质。另外我们通过定向进化对该类酶进行改造，获得了立体选择性得到明显提高的酯酶。
　　 通过GenBank数据库分析，从大肠杆菌K-12中筛选了酯酶基因，经PCR扩增后，获得了31个不同的酯酶基因片段，用内切酶双酶切后，与经过相同的限制性内切酶切割的载体pET-30a(+)连接，转化到大肠杆菌BL21中。重组菌在IPTG的诱导下表达，经过SDS-PAGE分析后，获得了相应的目标蛋白。
　　 建立了一种结合酯酶活性与立体选择性的高效筛选策略。以4-硝基苯丁酸酯为活性筛选的底物，通过检测405nm下的吸光度，获得了5个活性较好的酯酶(XL3，XL10，XL15，XL27，XL31)。再以1-乙酸苯乙酯作为底物进行立体选择性筛选，以1mmol/L溴百里香芬兰作为指示剂，利用酶标仪在630nm下检测各个酶催化水解反应中吸光度的变化，获得了对1-乙酸苯乙酯具有较高立体选择性的酯酶XL15。利用1-乙酸苯乙酯的水解反应和酯化反应对XL15进行复筛，转化率分别达到31.2％和36.8%，其对映体选择性(E值)均大于100。
　　 在对克隆获得酯酶的酶学性质的研究中发现，对于短链4-硝基苯酯，上述5个酯酶均具有较高的活性，但对于长链4-硝基苯酯，酶的活性明显下降。不同的酶的最佳反应pH值和反应温度亦不同。
　　 通过对酯酶XL15进行诱导表达条件的优化，获得了最佳蛋白表达条件：IPTG浓度为0.1mmol/L，诱导前菌体生长量为OD600=0.7，诱导温度为30℃。进一步对酯酶XL15进行蛋白纯化，获得了大小为28kDa的目标条带。通过序列分析与比对，XL15属于α/β/α水解酶结构，具有典型的Ser-His-Asp活性位点。初步预测表明，其活性中心附近存在一个类似“口袋”的结构，对于R-乙酸苯乙酯，手性碳上苯环的指向使得甲基能够比较好地契合到小口袋中，从而使该酶具有对R-乙酸苯乙酯较好的立体选择性。
　　 为了提高酯酶的立体选择性，我们采用了定向进化手段.所研究的酶为来自红球菌Rhodobacter sphaeroides的RSP_2728酯酶。整个过程中，我们建立了有效的定向进化策略和高通量筛选方法。利用易错PCR技术，进行了四轮突变，获得了突变株A6A5，B7F11，C8G1和D3E11，在对扁桃酸甲酯的水解反应中，其立体选择性相比较于野生菌株，对映体选择率（E值）从3.1分别提高到5.3，8.8，14.0和30.8;活性相对于野生菌株，从10U/mg分别提高到43U/mg，142U/mg，88U/mg和24U/mg。序列分析表明，突变体A6A5的62位上的氨基酸发生了突变，由原先的天冬酰胺变成了酪氨酸；突变体B7F11的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了酪氨酸，145位上的亮氨酸变成了组氨酸；突变体C8G1的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了半胱氨酸，145位上的亮氨酸变成了组氨酸；D3E11的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了半胱氨酸，121位的甲硫氨酸变成了颉氨酸，145位上的亮氨酸变成了组氨酸。由此可见，利用定向进化策略能够有效地提高酶的立体选择性。