妊娠诱导的Treg(piTreg)对器官移植保护作用的体外研究

摘要

目的：母胎免疫耐受模型——自然界中我们可以借鉴的一个天然的移植免疫耐受模型.由于正常妊娠与移植耐受机制有一定的相似性，而小鼠在妊娠期间调节性T细胞的数量有明显的增加，功能也具有一定的特殊性，本实验通过分离纯化孕鼠体内调节性T细胞(以下简称piTreg)，在体外刺激高纯度piTreg的扩增；并验证piTreg扩增后表达上的变化.此外，采用细胞共培养抑制试验的方法，以期初步评价Treg、piTreg和ex-Treg(体外扩增后Treg)对nave T细胞增殖抑制率的区别。
　　 方法：采用清洁级健康雌性小鼠C57/BL6(H2Kb)，雄性小鼠BALB/c(H2Kd)，体重均为18～23g.将C57/BL6雌性小鼠与BALB/c雄性小鼠同笼受孕。在孕0、7、12、16、20天数处死母鼠，并取少量非孕鼠做对照，提取脾脏单个核细胞.用流式仪分析孕不同时间piTreg在单个核细胞中的表达情况，确定piTreg(Treg)表达的动态变化；以及FoxP3在piTreg中的表达情况.用流式细胞分选仪分选piTreg(Treg)，确保纯度在90％以上.再将含高浓度的thIL-2和anti-CD3/CD28的扩增培养基，刺激分选后的Treg. piTreg. Naive T细胞和CD4+CD25-T细胞增殖，比较扩增情况；另将nalveT细胞进行CFSE染色，观察激活后T细胞增长规律。将分选获得的高纯度piTreg、Treg细胞和ex-Treg作为抑制细胞，分别与CFSE染色的效应细胞(nalve T细胞)和刺激细胞(CD4-T细胞)进行共培养，用ModFit软件分析效应细胞增殖指数，以比较各组抑制细胞的抑制效率。统计分析用SPSS16.0统计软件完成。
　　 结果：小鼠Treg占脾脏单个核细胞的1～2％，而piTreg占脾脏单个核细胞的比例>2％；piTreg中FoxP3约90％呈阳性.孕不同时期piTreg/CD4+T比例分别为：Od:5.27％，7d:7.79％，10d:17.70％，12d:22.99％，18d:16.88％.流式细胞分选仪分选后，目的细胞纯度可提高至95％以上。将分选获得Treg、piTreg、nalveT细胞和CD4+CD25-T细胞，在含有thIL-2和anti-CD3/CD28的特殊培养基中，相同条件培养，Treg和piTreg每2～3天增加l倍；而NalveT细胞和CD4+CD25-T细胞每2天增加2倍。CFSE荧光标记nave T细胞后扩增48h，流式分析可见：荧光强度随着细胞分裂逐代递减，通过ModFit软件分析，效应细胞(naveT细胞)与刺激细胞扩增培养3天后，nalve T细胞的增殖指数(PI)达20；而Treg、ex- Treg(expanded-Treg)及piTreg以1：1培养时，PI分别为：13.6、15.2、9.6。不同抑制细胞Treg、Treg/10、piTreg、ex-Treg对效应细胞的抑制率分别为0.37±07、0.05±.01、0.53±.01、0.24。piTreg的抑制效应最强。
　　 结论：⑴妊娠期小鼠体内piTreg会得到扩增，piTreg/CD4+T的比值随着孕期呈动态变化，孕中后期较高。⑵流式分选能将Treg(piTreg)纯度提高到95％以上，适宜于扩增。高浓度的thIL-2和anti-CD3/CD28能对T细胞进行有效扩增，但piTreg(Treg)的扩增效率较低，2倍/周.T细胞激活后能维持这种活化的状态，持续增殖。⑶nalve T细胞扩增3d后，增殖指数(PI)可达20。piTreg与naive T共培养后，PI仅为8.8，有明显的差异。Treg、ex-Treg和piTreg对效应细胞都有抑制作用，piTreg抑制效率最大。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1、背 景

2、第一部分 PiTreg(Treg)分选

2.1研究目的

2.2研究内容：实验材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5结论

3、第二部分 体外扩增

3.1研究目的

3.2研究内容：实验材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5结论

4、第三部分 体外抑制实验

4.1研究目的

4.2研究内容：实验材料与方法

4.3结果

4.4讨论

4.4结论

参考文献

综述 调节性T细胞与母胎免疫耐受的关系

作者简历及在学期间所取得的科研成果