一种体外诱导CD4+Foxp3+CD69+Treg的扩增方法及其用途

摘要

本发明提供了一种体外诱导CD4+Foxp3+CD69+Treg细胞及其制备方法，以及相关药物组合物和用途。本发明所采用的10μM蛋白酶体抑制剂MG132(Z‑Leu‑Leu‑Leu‑CHO)、预处理初始CD4+T细胞，能够获得至少65％的CD4+Foxp3+CD69+Treg；相比于对照组提高了91.4个百分点；经预处理后诱导的MG132Treg细胞具有更强的免疫抑制活性，诱导机体免疫耐受的重建，从而预防和/或治疗自身免疫性疾病，尤其是抑制炎症性肠病的发生发展。且本发明的方法容易实现体外培养和获取，成本低廉效率高，有利于诱导型Treg细胞治疗自身免疫炎症性疾病临床应用和开发。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种免疫抑制活性增强的CD69阳性调节性T细胞、制备方法，及其相关药物组合物和应用。

背景技术

调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)是一群具有免疫抑制功能并在维持体内免疫平衡中发挥重要作用的T细胞，其表面标志物是CD4、CD25和Foxp3，通常表达CD62L，CD44，CD28，OX40，FR4，CTLA-4和GITR。尽管Treg具有很强免疫调节能力，但在炎性微环境中Treg容易转化为Th17等细胞,导致其免疫抑制功能也大大受损；而且炎症性细胞因子会促使Treg的Foxp3表达下调，进而导致Treg向炎性细胞转化。CD4

CD69是一个早期白细胞活化分子，也是免疫调节分子。CD69通过促进TGF-β1的产生下调免疫反应，有报道称CD69

Treg来源于体内，没有经过化学修饰，容易被机体接受，不易引起排斥反应所产生的毒理效应，安全性较高；由于Treg细胞在外周血比例较少(<10％)、分离效率低、扩增困难，导致的细胞得率低也是Treg细胞免疫治疗方法的主要瓶颈。在临床上，现有细胞免疫治疗技术多采用直接抽血的方法，如需最终达到治疗剂量，每次采血量要求在200mL以上，即使这样也有高达1/3的患者采血后无法最终获得足够的治疗剂量的细胞无法进行后续治疗；且多次大量采血会对病人身体产生不良影响。因此，诱导培养生产具有更佳稳定和高效的Treg亚群对细胞疫苗的应用和自身免疫疾病的治疗都是至关重要的。目前传统方式诱导的Treg中CD4+Foxp3+CD69+Treg表达比例仅为35％左右，从而限制了其在疾病治疗领域的广泛应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种体外诱导CD4

优选的，本发明体外诱导的具有免疫抑制功能和高稳定性的MG132 Treg细胞，含有高水平的CD4

本发明的第一个目的是提供了一种体外诱导CD4

所述的百分比是通过流式检测所诱导CD4

优选的，所述初始CD4

优选的，所述初始CD4

进一步，所述初始CD4

优选的，所述蛋白酶体抑制剂预处理时间为1h-2.5h，

优选的，所述蛋白酶体抑制剂和初始CD4

优选的，所述蛋白酶体抑制剂可选自MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)、硼替佐米(Bortezomib)，卡非佐米(Carfilzomib)；进一步，优选为MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)。

优选的，所述蛋白酶体抑制剂MG132浓度为0.1-20μM，Bortezomib浓度为0.01-0.5μM，Carfizomib浓度为0.001-0.01μM。

优选的，经过MG132预处理获得的Treg包含至少55％的CD4

优选的，所述蛋白酶体抑制剂促进CD69表达不只限于CD4

优选的，所述传统方法为：取淋巴组织，经研磨、过滤后形成单细胞悬液，离心后弃上清，沉淀加入细胞分选液后进行计数，经分选后重悬于T淋巴细胞培养基中，同时加入细胞因子及活化抗体，培养诱导一定时间后使用检测Treg表达情况。

优选的，所述淋巴组织来源脾脏、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结及其他淋巴组织中的至少一种。

优选的，所述传统方式Treg诱导条件下使用的培养基包含细胞因子或活化抗体中的至少一种；

进一步，优选的，所述细胞因子为TGF-β1，浓度5-20ng/mL；更优选的，细胞因子TGF-β1浓度10ng/mL

进一步，优选的，所述细胞因子为IL-2，浓度50-100IU；更优选的，细胞因子IL-2浓度为50IU。

进一步，优选的，所述活化抗体anti-CD3/CD28浓度为0.5-2μg/mL；更优选的，活化抗体anti-CD3/CD28浓度为2μg/mL。

进一步，优选的，所述诱导时间为72-96h；

本发明的第二个目的是提供了一种体外免疫抑制活性增强的Treg细胞。所述免疫活性增强是指经过蛋白酶体抑制剂处理后的CD4

优选的，所述Treg分泌高于传统方式诱导的水平的IL-10和TGF-β1，进一步，免疫抑制相关分子GITR、ICOS高于传统方式诱导的Treg。

本发明的第三个目的是提供了一种CD69分子高表达的Treg。所述CD69分子高表达指的是Treg包含至少42％的CD4

优选的，硼替佐米(Bortezomib)处理能获得至少50％以上CD4

优选的，MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)处理能获得至少55％以上CD4

本发明的第四个目的是提供一种体外MG132 Treg细胞，所述MG132 Treg细胞是MG132通过活化HSF1并且促使其更多的与CD69启动子区域结合，确切说促进HSF1与HSE序列结合从而相互作用，进而促进初始CD4+T细胞诱导的CD4

优选的，所述的HSE序列为GAAnnTTC结构。

优选的，所述的更多为实验组相对于对照组(control组)比较得到。

优选的，所述的表达上调为实验组相对于对照组(control组)比较得到。

优选的，所述体外MG132 Treg细胞是体外MG132 CD69

本发明的第五个目的是提供一种体外MG132 Treg细胞，所述体外MG132 Treg细胞具有以下特征：

(a)所述免疫抑制功能的Treg是初始CD4

(b)MG132 Treg具有更强的免疫抑制活性，表现在MG132 Treg分泌更高水平的IL-10和TGF-β1，MG132 Treg免疫抑制相关分子GITR、ICOS高于Control Treg，MG132 Treg抑制CD4

(c)MG132 Treg能够抑制炎症性肠病的发生发展，并且其对肠炎的缓解能力优于Control Treg。本发明MG132 Treg能够抑制免疫反应、诱导机体免疫耐受的重建，从而预防和/或治疗自身免疫性疾病。

优选的，所述自身免疫性疾病选自炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、糖尿病、系统性红斑狼疮的至少一种。

优选的，所述MG132能够活化，促进初始CD4

优选的，所述体外MG132 Treg细胞是体外MG132 CD69

本发明的第六个目的是提供一种体外促进Treg细胞膜蛋白CD69表达的Treg细胞体外扩增培养基，所述Treg细胞体外扩增培养基配方包括Hepes、丙酮酸钠、β-巯基乙醇和抗生素中至少一种或几种。

优选的，所述Treg细胞体外扩增培养基的主体为含有10％血清的1640RPMI的T细胞专用培养基。

优选的，所述Treg细胞体外扩增培养基中Hepes浓度为10mM，丙酮酸钠浓度为1mM，β-巯基乙醇的浓度为5μM。

优选的，所述抗体选自CD3或CD28中的至少一种；进一步，优选的，所述抗体的添加量为0.5-10μg/mL，

优选的，所述细胞因子选自TGF-β1或IL-2中的至少一种；进一步，优选的，所述TGF-β1的添加量5-20ng/mL，所述的IL-2为50-100IU。

本发明的第七个目的是提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有安全有效量的上述MG132 Treg或有效量的MG132 CD69

优选的，在本发明的一个具体示例中，根据本发明的MG132 Treg或其盐的药学上有效的量可以是2.5×10

优选的，所述“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量；优选的，对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病征的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。

优选的，所述药物组合物还含有免疫抑制佐剂，更优选的，所述免疫抑制佐剂采用的是PBS。

优选的，所述的药物组合物中的Treg细胞或MG132 Treg细胞是自体的或异体的。

优选的，所述的药物组合物可将制成可注射剂，如液体溶液或悬液；还可制成注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

优选的，所述药物组合物通过静脉内、腹腔内其中至少一种方式施用。

优选的，所述药物组合物是经静脉注射方式应用，更优选的，治疗剂量方案选自单剂方案或多剂方案中的至少一种。

优选的，所述药物组合物可将其直接给予对象，待预防或治疗的对象是非人动物；更优选的，所述非人动物包括大鼠或小鼠其中的至少一种。

优选的，所述可接受的载体指用于治疗剂给药的载体或治疗性药物组合物中药学上载体；优选的，指的是本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性一些药剂载体。

优选的，所述可接受的载体为液体；更优选的，载体选自PBS或生理盐水中的至少一种。

优选的，所述可接受的载体还可能存在辅助性的物质如pH缓冲物质等。

对于本发明的药学组合物而言，除了使用作为有效成分的MG132之外，还可使用药学上适宜且生理学上允许的辅助剂来制得，所述辅助剂可使用二甲亚砜DMSO溶解，其化学式为C

本发明的第八个目的是提供如前所述任何一种形式的扩增方法获得的CD4

优选的，所述自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致的疾病；进一步，所述疾病与以下因素有关：

(a)免疫耐受丧失和隐蔽抗原暴露；

(b)外伤和感染激发自身免疫反应；

(c)遗传因素。

进一步，优选的，所述自身免疫性疾病选自炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、糖尿病、系统性红斑狼疮。

优选的，在本发明一个实施例中，所述用来过继回输治疗小鼠IBD的MG132 Treg细胞浓度可以是2.5×10

优选的，所述治疗在没有特别说明的情况下是指逆转或缓解疾患或疾病、或所述疾患或疾病的一种以上的症状，或者抑制或预防其发展。

特别说明，所述治疗在本发明一个实施例中是指基于如上所述的定义的治疗行为。在哺乳动物中，炎症性肠病及与此相关的疾病的“治疗”或“治疗方法”可包括下述情形的一种以上情形。

(1)阻止炎症性肠病及与此相关的疾病的发展；

(2)预防炎症性肠病及与此相关的疾病的扩散；

(3)减轻炎症性肠病及与此相关的疾病；

(4)预防炎症性肠病及与此相关的疾病的再次发作；

(5)缓解炎症性肠病及与此相关的疾病的症状。

有益效果

本发明通过对现有的Treg诱导表达体系进行了优化改良，建立了更加高效的诱导表达技术，节约了实验成本和时间，缩短了实验周期。优选的，与传统Treg诱导方法相比，MG132预处理初始CD4

在本发明中，术语“CD4

在本发明中，术语“CD4

在本发明中，术语“CD69

在本发明中，术语“MG132 CD69

在本发明中，术语“Control Treg”指传统方式诱导的Treg；

在本发明中，术语“iTreg”指的是体外诱导的Treg(induced regulatory Tcell)；

在本发明中，术语“Control CD69

在本发明中，术语“

在本发明中，术语“IBD”是指炎症性肠病。

在本发明中，术语“TGF-β1”指的是transforming growth factor-β1，转化生长因子1；

在本发明中，术语“HSF1”指的是heat shock factor 1，热休克转录因子1；

在本发明中，术语“HSE”指的是heat shock response elements，热休克反应元件；

在本发明中，术语“CFSE”指的是细胞标记物，指羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5，6-carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester)，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团。

在本发明中，术语“流式分选”指的是使用流式细胞分选仪，对流动中的单细胞或者生物颗粒进行多参数、定量分析的同时对特定群体加以分选，分选纯度高达99％。

在本发明中，术语“ELISA”指的是酶联免疫吸附实验，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原或抗体反应在固相表面从而进行定量的技术。

在本发明中，所用的细胞因子购自R&D公司；

在本发明中，所用的流式抗体购自ebioscience；

在本发明中，所用ELISA试剂盒购自赛默飞；

在本发明中，初始CD4

在本发明中，蛋白酶体抑制剂购自Selleck和Sigma；

在本发明中，引物由上海捷瑞生物公司合成；

在本发明中，CHIP试剂盒购自CST。在本发明中，所述MG132可以是由下述化学式1表示的化合物。特别说明，MG132化合物可以使用市场上销售的MG132化合物，不可以使用天然地分离或利用本领域公知的合成方法制造的MG132化合物。

附图说明

图1.ELISA检测IL-10和TGF-β1表达分析图。

图2.基因测序后，Control Treg和MG132 Treg的免疫抑制相关基因的表达水平热图；

图3.图3A流式分析MG132 Treg、Control Treg、MG132 CD69

图4.MG132预处理CD4+T细胞后HSF1及HSF1活化相关基因表达示意图；图4B利用荧光共聚焦检测MG132预处理CD4+T细胞后HSF1由细胞膜向细胞核转移情况示意图。

图5.流式分析HSF1

图6.流式分析经MG132预处理HSF1+/+或HSF1+/-小鼠的CD4+初始T细胞以及用KRIBB11阻断HSF1+/+小鼠的CD4+初始T细胞HSF1表达后的诱导的CD4

图7.HSF1蛋白和CD69基因启动子相互作用情况示意图。

图8.过继回输MG132 Treg、Control Treg、MG132 CD69+Treg、Control CD69+Treg至IBD小鼠，检测评价及治疗效果对比图。

图9.MG132 Treg、Control Treg、MG132 CD69+Treg、Control CD69+Treg过继回输治疗组小鼠Th1和Th17下调情况对比图。

特别说明，为了附图显示清晰和比例合适，附图中注释为CD69

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步说明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1蛋白酶体抑制剂促进CD4

目前传统方式诱导的Treg中CD4

ELISA试剂盒检测上述培养细胞分泌的TGF-β1和IL-10水平，显示10μM MG132促进Treg的IL-10和TGF-β1的分泌能力最强，另外其IL-10和TGF-β1是对照组的1.5-2倍，0.01μM、0.1μM Bortezomib以及0.001μM Carfizomib组IL-10表达水平亦有所上调(图1)。

在培养过程中使用T淋巴细胞培养基，其制备方法为：于含10％FBS的1640培养基中加入终浓度为5μM的β-巯基乙醇，1mM的丙酮酸钠，10mM的Hepes,并加入三抗。

本实施例中，通过流式检测所诱导的初始CD4

表1不同浓度蛋白酶体抑制剂处理对Treg和CD4

实施例2.MG132 Treg和Control Treg的基因表达差异

为明确MG132 Treg和Control Treg在基因表达方面的差异，采用流式分选仪(仪器型号：BD FACS S ORP ARIA II)分选了实施例1中的10μM MG132预处理诱导的MG132Treg和对照组Control Treg，进行基因测序，图2结果表明MG132 Treg免疫抑制相关基因IL-10、TGF-β1、SOCS2、HSP90AA1、GITR、Gzmb、CTLA-4等表达水平明显高于Control Treg，同时MG132 Treg组促炎相关因子IL-17A、IL-17F表达较Control Treg有所下调。

其中，流式细胞分选buffer为：PBS，pH 7.2，加入终浓度为0.5％的BSA以及2mMEDTA,过滤后分装。

流式细胞分选上样buffer为:HBSS,pH 7.2,加入终浓度为1％的BSA，4×双抗。

流式细胞分选收集buffer为:RPIM 1640培养基，加入终浓度为30％的血清，4×双抗。

实施例3.MG132 Treg特征分析

收集各组细胞，1×10

实施例4 MG132促进HSF1及相关基因活化

10μM MG132预处理CD4

表2 Real-time PCR所使用的引物

实施例5.MG132在体内促进Treg的CD69表达依赖于HSF1

为进一步明确MG132促进CD69

本实施例中，所述“HSF1

本实施例中，所述“HSF1

实施例6.MG132通过HSF1体外诱导CD4

分选HSF1

实施例7.MG132促进HSF1结合CD69启动子区域

通过分析CD69启动子区域序列，发现在其启动子前有能与HSF1结合的两个经典HSE(Heat Shock response elements)序列，即GAAnnTTC结构，具体见图7A，进一步通过染色质免疫沉淀技术即CHIP(Chromatin immunoprecipitation)实验验证HSF1与CD69相互作用情况，分选CD4

实施例8.MG132 Treg/MG132 CD69

由于MG132能够促进CD4

小鼠结肠炎组织学评分标准主要根据炎症程度、病变深度、隐窝破坏、再生指数和病变范围(％)限定，具体为：0分，无炎症；1分，轻度炎症，2分，中度炎症，3分，重度炎症。0分，病变深度无；1分，累及粘膜层；2分，累及粘膜层与粘膜下层；3分,全层炎。0分，无隐窝破坏；1分，基底1/3隐窝被破坏；2分基底2/3隐窝被破坏；3分,仅表面上皮完整；4分，全部隐窝和上皮被破坏。0分，完全再生或止常组织；1分，几乎完全再生；2分，再生伴隐窝缺损；3分，表面上皮不完整；4分，无修复。1分，病变范围1-25％；2分，病变范围26-50％；3分，病变范围51-75％；4分，病变范围76-100％。

实施例9.MG132 Treg/MG132 CD69

致炎性Th1(CD4

综上实施例所述，发现CD4

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。