尼克酰胺N-甲基化酶高表达的人结肠癌细胞株SW480的构建

摘要

尼克酰胺N-甲基化酶(NNMT)是一种S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)依赖性胞质酶,其主要功能是以SAM为供体,催化尼克酰胺和吡啶类物质的甲基化,形成吡啶盐。NNMT与疾病相关的报道,大多与帕金森症相关。但是近年来NNMT在肿瘤研究方面的的报道越来越多:NNMT的蛋白含量和mRNA水平在结直肠癌、甲状腺乳头状癌、肾透明细胞癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌等肿瘤组织中表达明显升高,且多种肿瘤患者的血清中亦存在NNMT的高表达。现有研究结果显示,NNMT表达变化可能影响肿瘤的生长增殖、转移和治疗,有可能成为一个潜在的肿瘤诊断标志物。但目前对NNMT在肿瘤细胞中的高表达的意义或确切作用尚不明确,仍需细胞学实验证实。本实验的目的在于构建NNMT高表达的大肠癌细胞株SW480模型,为研究NNMT在肿瘤细胞中的作用提供有力的研究工具。
　　 目的：构建NNMT高表达的大肠癌细胞株SW480模型,研究NNMT的表达变化对肿瘤细胞的生长、增殖、细胞周期等的影响。
　　 方法：将原核表达载体pGEX-4T-2/NNMT经BamHI/Xhol双酶切获得NNMT目的基因,与同样经过双酶切的pcDNA3.1(+)连接,构建NNNT真核表达载体pcDNA3.1-NNMT。通过脂质体法将pcDNA3.1-NNMT稳定转染于大肠癌细胞株SW480,成功构建了NNMT高表达的大肠癌细胞株SW480模型,研究NNMT的表达变化对SW480生长曲线、细胞周期等的影响。
　　 结果：限制性内切酶和DNA测序结果表明,编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到pcDNA3.1(+)多克隆位点,成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-NNMT;RT-PCR结果显示转染NNMT的SW480细胞中NNMT mRNA表达量明显上调,Western blot可见清晰NNMT蛋白条带,空载组和对照组则不表达该蛋白,提示NNMT高表达人结肠癌细胞株SW480(SW480-pcDNA3.1/NNMT)构建成功;SW480-pcDNA3.1/NNMT细胞生长速度明显快于其他两组细胞,其生长曲线发生一定程度的左移,从第72小时开始,生长增殖能力与对照组相比具有统计学差异;但细胞周期结果显示三组细胞无明显差异。
　　 结论：
　　 1、成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-NNMT。
　　 2、成功构建NNMT高表达的人结肠癌细胞株SW480。
　　 3、NNMT高表达的SW480细胞生长速度明显加快,其生长曲线发生一定程度的左移。