杂交瘤细胞株Zj/2D8及其检测尼克酰胺-N-甲基化酶抗原的应用

摘要

本发明公开了一种杂交瘤细胞株Zj/2D8及在检测尼克酰胺-N-甲基化酶抗原中的应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月22日，保藏编号为CCTCC NO：C2013149，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072；本发明提供的杂交瘤细胞株Zj/2D8能够高效分泌NNMT单克隆抗体蛋白，对NNMT抗原具有很高的抗体效价，较好的亲和力和较高的纯度，可应用于临床检测，通过对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种蛋白免疫学检测方法，具体涉及一种可以抗尼克酰胺 -N-甲基化酶蛋白的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株、制备方法 及该单克隆抗体的用途。

(二)背景技术

恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病。据世界卫生组织最新数据 显示，每年全球癌症新发病例1000多万，死亡700多万，占总死亡人数 的12％。到2020年前，每年将新增1500万癌症患者，不仅如此，癌症 的死亡人数也在全球迅速上升，2030年这个数字可能会增至1320万。

肿瘤的早期诊断是肿瘤防治的关键，肿瘤的死亡和复发的危险性与初 诊时的分期密切相关，且化疗、放疗的敏感性一定程度上取决于癌细胞内 的酶或蛋白分子。生物标志物是细胞处于特定条件下代表该细胞生物学状 态的重要信号指示分子。为了降低肿瘤的死亡率或提高治疗的效果，许多 研究致力于肿瘤关键生物标准物的发现和筛选。因此，寻求肿瘤早期诊断、 分期或/和指示化疗、放疗的敏感性、预后以及潜在治疗靶点的肿瘤标志 物一直是肿瘤学的研究热点。

尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2.1.1.1)正常表达于人肝脏组织 中，其他组织如肠、肺、肾、胎盘、心脏、骨骼肌、脑、胰腺表达很低或 者没有表达。NNMT在不同人的肝脏中活性差异较大，活性的高低取决 于胞浆中NNMT的浓度，NNMT的浓度与NNMT的mRNA水平有关， 与基因的多态性无关，通常认为NNMT过表达的机制是由于基因翻译后 调控异常所致，可能受肝细胞核因子-1(HNF-1)、TGF-β1、STAT3等激 活。

NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)为供体，催化尼克 酰胺和吡啶类物质的甲基化，形成吡啶盐，在正常肝细胞中参与药物的生 物转化，是催化药物、异型生物质代谢的一种酶。NNMT是维持尼克酰 胺平衡的关键酶，所以可以推测NNMT的增高可影响尼克酰胺参与细胞 的功能。尼克酰胺是NAD分子的组成部分，可通过补救合成途径生产 NAD，而NAD参与细胞的很多基本可能如能力代谢，对应和损伤的抵抗， 细胞的寿命等。帕金森综合症被认为与NNMT增高引起的尼克酰胺代谢 异常有关，在脑组织中该酶活性过度增高通过两条途径导致帕金森综合 症，一是生成神经毒物N-甲基吡啶(如N-甲基-4苯基吡啶(MPP+))激 活导致线粒体复合体1受损，二是降低了尼克酰胺导致能量代谢障碍。尼 克酰胺还能抑制多聚ADP聚合酶(PARP)，而PRAP通过碱基切除修复、 坏死、凋亡等多细胞调节来保持基因组的完整性。因此有理由推测NNMT 可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响 化，放疗效果。如能明确NNMT在肿瘤细胞中的作用，并阐明NNMT在 肿瘤中的作用机制或分析其下游相关分子组成的模块或通路，必将进一步 明确NNMT作为在肿瘤防治中的价值。

近年来，用蛋白助学和基因芯片技术比较不同癌组织和癌旁组织差异 时发现NNMT在多种癌组织中异常表达。与正常组织和癌旁组织相比， NNMT在结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺乳头状癌、肾透明细 胞癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌和胰腺等肿瘤组织有过表达，并在多种肿 瘤患者的血清中升高。这些研究提示NNMT与肿瘤发生密切相关，推测 NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关， 或可影响化、放疗效果。

(三)发明内容

本发明采用尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作为免疫原免疫小鼠制备了能 稳定分泌抗NNMT单克隆抗体的细胞株，然后通过NNMT蛋白的间接 ELISA法筛选并进一步纯化获得了能分泌NNMT抗体的细胞系及由所属 细胞系提取的单克隆抗体，因此本发明目的是提供一株高效分泌抗 NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)抗体的杂交瘤细胞株，利用该细胞株提 取NNMT抗体，采用NNMT抗体对待测组织中的NNMT抗原进行检测， 进而确定待测组织中NNMT抗原的含量，有助于临床诊断。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株杂交瘤细胞株Zj/2D8，保藏于中国典型培养物保藏 中心，保藏日期为2013年10月22日，保藏编号为CCTCC NO：C2013149， 保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072。

本发明还涉及一种所述杂交瘤细胞株Zj/2D8在检测尼克酰胺-N-甲 基化酶(NNMT)抗原中的应用，具体所述的应用是提取杂交瘤细胞株 Zj/2D8中的NNMT抗体，再根据抗原抗体特异性结合原理，利用NNMT 抗体检测待测样品中NNMT抗原含量。

本发明所述NNMT抗体的提取方法为：(1)将杂交瘤细胞株Zj/2D8 用含10％胎牛血清的1640培养液，在37℃，含5％CO₂的细胞培养箱内 扩大培养，收集细胞，用PBS(pH值为7.4)配制成0.4×10⁶/ml的细胞 液，再将细胞液腹腔注射石蜡致敏的BALB/c小鼠(不限于BALB/c小鼠， 本领域公知的小鼠型号均可)，每只注射1ml，接种后9天收获腹水，1200 转/分钟离心，除去沉淀，收集上清液；

(2)向步骤(1)收集的上清液中加入2倍体积的pH 5.0、0.06mol/L 醋酸钠缓冲液，再用1mol/L HCl调pH至4.8，制成稀释上清液；然后按 每毫升稀释上清液中加11μl辛酸的比例，室温搅拌下向稀释上清液中逐 滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出，15000g离心30 分钟，弃沉淀；上清经125μm尼龙筛过滤后，滤液加入1/10体积的 0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调pH至7.2；在4℃下加入硫酸铵至45％ 饱和度(所述45％饱和度是指质量浓度)，搅拌30分钟，静置1小时， 10000g离心30分钟，弃上清，沉淀以含137mmol/L NaCl+2.6mol/L KCl+0.2mmol/L EDTA的PBS为透析液进行透析，4℃过夜，直至用10g/L  BaCl₂水溶液检测截留液无SO₄离子，取出截留液，10000g离心30分钟， 除去不溶性沉渣，上清即为NNMT抗体。

本发明提供的杂交瘤细胞Zj/2D8所产生的单克隆NNMT抗体对于 NNMT抗原均有高水平的抗体效价，因此单克隆NNMT抗体、其活性片 段或其保守性突变体以及标记的活性片段或其保守性突变体，或其任意组 合均可用于制备检测NNMT抗原的试剂、药剂或试剂盒。本发明所述制 备检测NNMT抗原的试剂、药剂或试剂盒优选采用双抗夹心法检测 NNMT抗原。

对于本发明所述标记的活性片段或其保守性突变体，是指本领域公知 的生物标记或化学标记。例如酶标记、荧光标记(例如荧光素标记)或化 学发光标记。优选地，所述酶标记为辣根过氧化物、丙酮酸激酶或葡萄糖 氧化酶标记。

本发明所述单克隆抗体优选为人源化的单克隆抗体(人源化抗体主要 指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体， 其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和 力和特异性，又降低了其异源性)。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)本发明提供的单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8能够高效分泌(是指 在实施例1的1.3中培养液上清稀释1000倍后检测细胞分泌到上清液中 的抗体亦为阳性)NNMT单克隆抗体蛋白。

(2)本发明从单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8提取的NNMT单克隆抗体 对NNMT抗原具有很高的(1：1000000)抗体效价，较好的亲和力和较 高的纯度，提示该单克隆抗体可应用于检测NNMT抗原的科研研究领域。

(2)本发明的从单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8提取的NNMT单克隆 抗体可应用于临床检测，通过对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测 该组织中NNMT蛋白的表达情况。

(四)附图说明

图1为Zj/2D8、1E7和2F8纯品抗体SDS-PAGE电泳图，M：Marker，1： Zj/2D8纯品抗体，2：1E7纯品抗体，3：2F8纯品抗体。

图2为Zj/2D8、1E7和2F8细胞株分泌抗体的亚类、轻链型图，A为Zj/2D8、 B为1E7，C为2F8C。

图3为Zj/2D8纯品抗体凝胶扫描图。

图4为Zj/2D8、2F8和1E7细胞株纯品抗体的亲和力反应曲线图。

图5为Zj/2D8细胞株单抗的免疫印迹，1：GST蛋白，2：NNMT-GST 融合蛋白，3：NNMT蛋白。

图6为10条合成短肽的免疫印迹。

图7为大肠癌细胞株及阳性细胞株HT-29细胞NNMT慢病毒干扰后的免 疫印迹。

图8为裸鼠移植瘤HT-29细胞(A)及NNMT干扰后HT-29细胞(B)的免疫 组化(×100)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

本发明百分浓度，若没有特殊指明，皆是质量浓度，溶剂皆是水。

实施例1：杂交瘤细胞系的获得、单克隆抗体的筛选、制备及鉴定

1、单克隆抗体的制备

按照本领域已知的常规方法制备本发明抗NNMT的单克隆抗体杂交 瘤细胞株Zj/2D8，主要参照美国专利5585089中所述的原则和方法制备 人源化形式的抗NNMT的单克隆抗体杂交瘤细胞株Zj/2D8(常见Kohler  and MIlrtein,Nature 256:495-96,1975)，方法中将提到如下试剂：

(1)包被液：Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，NaN₃0.2g，溶于1L水 中，调pH至9.6。

(2)封闭液：1％小牛血清白蛋白。

(3)洗涤液：0.5mlTween-20溶于1000ml 1×PBS中。

(4)TMB显色液(包括底物显色A液和B液)，底物显色A液： 醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml；底物 显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50ml、取0.15g 四甲基联苯胺(TMB)溶于3ml DMSO中，蒸馏水加至500ml。使用时 各取50μl混合即可。

(5)终止液：2.0mol/L H₂SO₄水溶液。

1.1、免疫原的制备

免疫原为GST-NNMT融合蛋白及NNMT蛋白，利用基因工程技术制 备NNMT蛋白：根据NCBI核苷酸数据库编码为gi:12652950人NNMT  cDNA序列，合成NNMT基因的PCR引物，

P1(sense):3′-CG'GGATCC'ATGGAATCAGGCTTCACCTCC-5′；

P2(antisense):3′-G'CTCGAG'AATTGAGGTCACAGGCATCACAG-5′。

在P1的5'端和P2的3'端设计BamHI和XhoI位点。以肝c DNA为 模板(序列与上述NCBI核苷酸数据库编码为gi:12652950人NNMT  cDNA序列一致)，在引物P1、P2作用下进行PCR扩增NNMT片段， 反应参数为94℃预变性2min，94℃20s、60℃30s、72℃45s。20次循环 之后，立即加入0.8μl Taq酶，72℃延长10min，4℃保存。PCR产物经 胶回收后，T-A克隆至PGEM-Teasy载体，得pGEM-T-Easy-NNMT 质粒，质粒经测序验证后用BamHI和XhoI酶切，回收DNA片段，连接 到p GEX-4T-2载体，构建pGEX-4T-2/NNMT质粒，转化到大肠杆菌 BL-21-STAR(DE3)中以表达GST-NNMT融合蛋白，获得重组大肠杆菌 BL-21-STAR(DE3)-GST-NNMT，37℃培养2h后，用终浓度0.1mM的IPTG 在30℃诱导3h，4℃，5000rpm离心10分钟，收集菌体，使用scientz-ⅡD 超声波细胞粉碎机，在100瓦，超声10秒，停10秒，60个循环的条件下超 声破碎菌体，13000rpm离心3分钟后，留取上清液，将上清液经Glutathione  Sepharose 4B(购自美国Pharmacia公司)亲和层析柱纯化GST-NNMT蛋白。 然后向GST-NNMT蛋白中加入凝血酶(每1mg蛋白加入10U凝血酶)使其 充分酶切，再次经过Glutathione Sepharose 4B(购自美国Pharmacia公司) 亲和层析柱，室温轻摇30分钟，使GST蛋白与亲和层析柱充分结合，收集 流出液，500g离心5分钟，收集上清，上清中仅含有NNMT蛋白，获得纯 化后的NNMT蛋白。用邻苯三酸红法测定蛋白浓度，10％SDS-PAGE电泳 和Western-blot鉴定NNMT蛋白，上清液中仅含有NNMT蛋白。

1.2、动物免疫：免疫程序为：初次免疫取8周龄BALB/C雌性小鼠， 将NNMT蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后，在小鼠背部皮下多点注射， 剂量为每只小鼠140μg。30天后，再次用NNMT蛋白与弗氏不完全佐剂 等体积混匀后，在小鼠背部皮下多点注射，剂量为每只小鼠140μg。之后 每隔10天再用NNMT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀物免疫一次，共 三次，作为加强免疫。最后进行细胞融合前三天，NNMT蛋白与生理盐 水等体积混匀后腹腔注射，剂量为每只小鼠80μg。弗氏不完全佐剂组成 为液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分体积比为2：1，弗氏完全佐剂组成 为弗氏不完全佐剂中加卡介苗(浓度5mg/ml)。

1.3、细胞融合：取免疫BALB/C鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤(购自 中科院细胞库)按比例(5：1)融合，1200rpm离心5分钟，弃上清。 37℃下，1分钟内向细胞沉淀加入50％PEG(0.8ml每10⁸脾细胞)，静置 融合90秒，1200rpm离心5分钟，弃上清，加入20ml HAT选择培养液 (每500ml HAT选择培养液中含1640培养基400ml，胎牛血清100ml， 50×HAT 10ml(sigma))，铺96孔细胞培养板，采用HAT选择培养液培 养杂交瘤细胞(正常的细胞培养，37℃，5％CO₂的细胞培养孵箱内)，选 择存活下来的即是杂交瘤细胞。BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞 完成细胞融合，细胞融合率为96.7％。第七天采用间接ELISA法检测细 胞上清，以筛选阳性细胞。间接ELISA法如下：将NNMT蛋白用包被液 稀释成0.025μg/ml，每孔100μl包被酶标板，GST-NNMT蛋白用包被液 稀释成0.04μg/ml，每孔100μl包被酶标板，4℃放置过夜。次日，洗涤液 洗涤3次，加封闭液约350μl/孔，37℃、1小时，洗涤液洗涤后拍干。每 孔加入杂交瘤上清100μl，设阳性血清对照(免疫后小鼠的血清，多抗)、 阴性血清对照(未免疫小鼠的血清)，同时设置空白对照孔(1×PBS)， 37℃反应2小时后，洗涤液洗涤酶标板，加入100μl兔抗小鼠IG-HRP(Cell  signaling Technology)(用PBS1：4000稀释)，37℃反应1小时后洗涤酶 标板，加入TMB显色液，37℃显色15分钟，加终止液终止反应，分光 光度计(BIO RAD,Model 680,Japan)上读取OD₄₅₀的吸光度。融合细胞的 初筛阳性率为62.4％。在大约一百例初筛阳性中选择抗NNMT滴度高(达 到1：1000)且抗GST-NNMT滴度很低(低于1：10)的杂交瘤细胞株 21例，进一步克隆化(将一个阳性孔内的细胞挑取单克隆到96孔板中扩 大培养，再进行上述鉴定，直到这个孔的细胞挑出来的全为阳性，即为单 克隆抗体株)直至阳性率达到100％，从而筛选到单克隆抗体杂交瘤细胞 株Zj/2D8、杂交瘤细胞株1E7和杂交瘤细胞株2F8，杂交瘤细胞株1E7 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年8月31日，保藏编号 CCTCC NO:C201167，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072；杂 交瘤细胞株2F8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2015年1月 15日，保藏编号CCTCC NO:C201506，保藏地址为中国武汉武汉大学， 邮编430072。

结果，阳性血清对照的OD值为2.192，阴性血清对照的OD值为 0.101，空白孔OD值为0.097，经过筛选，所获得的目的细胞株所对应的 OD值如表1所示。

表1 单克隆抗体细胞株筛选细胞上清OD值

由此筛选出的3株杂交瘤细胞株均能分泌抗NNMT蛋白的抗体且 OD值大于1.4。而且抗GST-NNMT的OD值均很低，几乎与空白孔的 OD值一致。其中杂交瘤细胞株Zj/2D8的抗NNMT蛋白OD值明显高于 杂交瘤细胞株1E7和杂交瘤细胞株2F8，且抗GST-NNMT的OD值更低。

1.4、腹水制备：将杂交瘤细胞株Zj/2D8扩大培养(正常的细胞培养， 37℃，5％CO₂的细胞培养孵箱内)，收集细胞后用PBS配制成0.4×10⁶/ml 细胞液，将细胞液腹腔注射石蜡致敏(石蜡致敏是指腹腔注射1ml石蜡/ 只)的BALB/c小鼠，每只注射1ml，接种后9天收获腹水，1200转/分 钟离心，除去沉淀，收集上清液，即为上层单克隆抗体腹水。

1.5、抗体纯化：1份上清液(步骤1.4制备)中加入2份醋酸钠缓 冲液(0.06mol/L，pH 5.0)，用1mol/L HCl调pH至4.8，制成稀释上清 液。按每毫升稀释上清液加11μl辛酸的比例，室温搅拌下向稀释上清液 中逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心 30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125μm)后，滤液加入1/10体积 的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调pH至7.2；在4℃下加入硫酸铵至 45％饱和度，搅拌30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清； 沉淀以含137mmol/L NaCl+2.6mol/L KCl+0.2mmol/L EDTA的PBS为透析 液(透析袋的截留分子量为14000)，用50-100倍沉淀体积的透析液进 行透析，4℃过夜，其间换透析液3次以上，直至用10g/L的BaCl₂水溶 液检测截留液无SO₄离子。取出截留液，10000g离心30分钟，除去不溶 性沉渣，上清即为纯化的NNMT单克隆抗体，紫外分光光度法测定蛋白 质含量后，加入0.02％NaN₃分装保存备用。腹水粗品经4％辛酸提取与 50％硫酸铵盐析，主要的杂蛋白，如白蛋白等几乎全部被去除。SDS-PAGE 电泳显示(图1)纯化后除抗体的重链(50KD)及轻链(25KD)条带之 外的杂带较少，表明纯化效果较好。

1.6、抗体的鉴定

1.6.1、杂交瘤细胞分泌的抗体的亚类及轻链型，使用sigma-aldrich公 司的IsoQuick Kits for Mouse Monoclonal Isotyping检测：(后文提到的本 实验制备的抗体或者是Zj/2D8皆是指1.,5纯化制备所得)1.5纯化制备所 得Zj/2D8分泌的NNMT抗体，为IgG2aκ类(图2中A)，与1E7杂交瘤 细胞株类型相同(图2中B)，但与2F8分泌的抗体为IgG2bκ类不同(图 2中C)。

1.6.2、纯品抗体的纯度及分子量：1.5纯化制备所得NNMT抗体经 SDS-PAGE电泳和凝胶扫描分析后，抗体纯度为91.4％(图3)。轻链分 子量约为25KD，重链分子量约为50KD，与抗体分子的特性相符。

1.6.3、纯品抗体效价与亲和力分析：1.5纯化制备所得NNMT抗体、 1E7、2F8细胞株纯品抗体经间接法ELISA分析后，抗体效价均在100000 以上，但ZJ/2D8分离的NNMT抗体要高于1E7和2F8(如表2和图4) 分离的抗体。具体方法如下：将NNMT蛋白用包被液稀释至0.025μg/ml 后包酶标板，4℃过夜。酶标板中加封闭液，37℃封闭1小时后，洗涤液 洗涤。洗涤拍干后，分别加Zj/2D8分离的NNMT抗体、1E7分离的抗体、 2F8分离的抗体(10mg/ml)，按1:100～1:10⁷的10倍比例(表2)和2 倍比例(图4)稀释量入孔，37℃洗涤2小时后，加入100μl二抗兔抗 鼠HRP-IgG 1小时后洗涤。最后TMB显色液显色15分钟，加入终止液 终止反应，测定波长450nm的OD值(表2)。表明经纯化后，抗体的效 价有所增高，并保持了抗体的免疫活性。

表2 Zj/2D8、1E7和2F8提取的单克隆抗体对NNMT蛋白间接法抗 体效价结果

结果以抗体浓度的对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制单抗亲和力 的测定曲线(如图4)。Zj/2D8细胞株达到最大结合50％时的抗体浓度(单 位μg/ml)为0.11μg/ml，比1E7的0.34μg/ml和2F8的0.22μg/ml都要低， 表明Zj/2D8细胞株所分泌抗体的相对亲和力比1E7和2F8株都要高，其 亲和力已能满足于生产各类检测试剂和试剂盒。

1.7、抗体特异性鉴定(采用Western-blot)

1.7.1、方法

a.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

(1)按表配制聚丙烯酰胺15％分离胶。最后一步加入TEMED，混匀 后，小心地将分离胶注入准备好的玻璃凝胶模中，上面要为浓缩胶留 1.5-2cm的空隙。在顶层加水覆盖，使界面平整，并防止空气中的氧气对 凝胶聚合起抑制作用，室温下放置约30分钟，使之聚合。聚合完成后，倾 去分离胶上的水，尽量用吸水纸吸干凝胶顶端的残存液体。

(2)按表配制5％浓缩胶，混匀后加入玻璃凝胶模，插上梳子，室温 下放置30分钟。将凝胶电泳板放入电泳槽，浸没于1×Tris甘氨酸电泳缓 冲液中，小心移去梳子。

(3)准备样品：取上样缓冲液8μl，1M DTT 2μl，蛋白样品10μl，置 于0.5ml的离心管中，沸水浴10分钟后立刻置于冰上。

(4)上样：每个泳道分别用微量加样器加样10μl。

(5)接通电源，35mA电泳10～15分钟，使蛋白质快速泳动至分离胶 上层并浓缩成一条窄带；电压改为25mA，继续电泳约1.5小时，直至示踪 染料接近凝胶的底端。

b.转膜及显影

(1)取4张与电泳凝胶大小一致的滤纸和一张氟化聚偏二乙烯滤膜 (PVDF，Polyvinylidene-Fluoride)，用甲醇浸泡15分钟至滤膜呈透明。

(2)将两层滤纸放在固定的转移装置上，将己电泳好的聚丙烯酰胺 凝胶放在滤纸上，然后将PVDF滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，PVDF滤膜 上再覆盖两层滤纸，每一步都要用玻璃棒赶去气泡，然后固定装置。

(3)将整个装置置于电泳槽中，注意使凝胶层位于负极，滤膜层位 于正极，在转移电泳槽中加入预冷的转移缓冲液。

(4)接通电源，250mA转移2小时。

(5)封闭:在封闭液中室温转动60分钟。

(6)加一抗：一抗(抗NNMT单抗)用封闭液稀释，配稀释后一抗2ml (体积比1：12000)，将膜放入其中，4℃转动过夜。

(7)用封闭液室温浸洗膜3次，每次10分钟。

(8)加二抗：将二抗兔抗小鼠(IgG-HRP)(Cell signaling  Technology)，用封闭液1:5000稀释，配稀释后二抗2ml，将膜放入其中， 室温转动2小时。

(9)用浸洗液室温浸洗条带3次，每次10分钟。

(10)加ECL显影液后显影。

结果经Western-blot鉴定单克隆抗体，在PVDF (Polyvinylidene-Fluoride)膜上，只有NNMT-GST融合蛋白(55KD)及 NNMT蛋白(29KD)泳道相应分子量区域出现一条明显的特异性条带， 而在GST蛋白(26KD)泳道未出现相应条带(如图5所示)。

1.8、抗体抗原表位鉴定

1.8.1、方法

a.NNMT短肽的合成：根据NNMT蛋白氨基酸序列(mesgftskdt  ylshfnprdy lekyykfgsr hsaesqilkh llknlfkifc ldgvkgdlli digsgptiyq llsacesfke  ivvtdysdqn lqelekwlkk epeafdwspv vtyvcdlegn rvkgpekeek lrqavkqvlk  cdvtqsqplg avplppadcv lstlcldaac pdlptycral rnlgsllkpg gflvimdalk  ssyymigeqk fsslplgrea veaavkeagy tiewfevisq sysstmanne glfslvarkl srpl)及 结构分析，委托杭州中肽生化有限公司设计并化学合成10条短肽 (N1-N10)(表3)。

b.Western-blot和Elisa方法鉴定抗体识别抗原表位：利用Elisa方法 进行抗原表位鉴定，将合成的10条短肽作为包被抗原，以作为阴性对照， 按照间接Elisa方法(如1.6.3)进行，结果显示Zj/2D8组的第3条短肽 呈阳性，说明Zj/2D8识别的抗原表位为N3 (SGPTIYQLLSACESFKEIVVTD)，而1E7和2F8均无响应短肽与其对 应。同时利用Western-blot进行验证，将这些短肽进行SDS-PAGE电泳后， 转印至NC膜上，分别用3株单抗作为一抗，羊抗鼠HRP-IgG作为二抗， 经DAB显色，结果与Elisa实验结果一致(图6)。因为Zj/2D8有明确的 抗原识别表位，而1E7和2F8还没有明确的抗原识别表位，所以Zj/2D8 更适合于生产各类检测试剂和试剂盒，用于各类检测和研究。

表3 10条合成短肽序列信息

名称 起始位置 序列 终止位置 N1 8 KDTYLSH 14 N2 33 AESQILKHLLKNLFKIFCLDGVKGDLLID 61 N3 64 SGPTIYQLLSACESFKEIVVTD 85 N4 106 DWSPVVTYVCD 116 N5 181 RNLGSLLKPGGFLVIMD 179 N6 199 LKSSYYM 197 N7 210 KFSSLPLGR 218 N8 220 AVEAAVKE 227 N9 233 EWFEVISQS 241 N10 251 GLFSLVARK 259

1.10、抗体分泌稳定性的测定

将制备的3株杂交瘤细胞在冻存6个月以及12个月复苏，生长状态 良好，用间接Elisa方法鉴定，OD_450nm值为1.3～2.0，表明分泌抗体的能 力均稳定。

实施例2：单克隆抗体应用于免疫组化检测临床标本(采用二步间 接法)

1、本实验生产的抗NNMT单克隆抗体可以应用于临床病理标本的免 疫组化实验。我们选用杂交瘤细胞株Zj/2D8分离的NNMT单克隆抗体(实 施例1中1.5纯化后制备所得)对不同组织进行免疫组化实验。先将一抗 (特异性抗体--NNMT单克隆抗体)与相应的组织抗原结合，形成抗原抗 体复合物，再用二抗(酶标记的抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成 抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。具体方法如下：

(1)石蜡NNMT干扰后的HT-29细胞(购自中科院细胞库)移植裸 鼠，移植瘤的组织切片脱腊至水(常规术语，就是用二甲苯-无水酒精脱 去石蜡，然后经过无水酒精70％酒精，50％酒精依次过渡到水)。

(2)1×PBS冲洗，每次5分钟，共3次。

(3)3％过氧化氢甲醇溶液作用20分钟，阻断内源性过氧化物酶活 性。

(4)1×PBS冲洗，每次5分钟，共3次。

(5)封闭液封闭10分钟。

(6)用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复。

(7)每张切片滴加实施例1制备的NNMT抗体作为一抗(1×PBS 1： 16000稀释)，37℃、60分钟或4℃冰箱过夜。

(8)1×PBS冲洗，每次5分钟，共3次。

(9)滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠的二抗(1:5000)，37 ℃、40分钟。

(10)1×PBS冲洗，每次5分钟，共3次。

(11)加入100μl新鲜配制的3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色溶液(美 国GENMEM公司)，10分钟。

(12)自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。

同样条件以HCE8693细胞作为对照。

2、大肠癌细胞株的免疫印记

其中HCE8693和HT-29细胞显示NNMT阳性(图7)，HT-29细胞 慢病毒干扰NNMT表达后NNMT阳性减弱(图7)。

3、HT-29细胞及NNMT干扰后的HT-29细胞移植裸鼠的免疫组化

HT-29细胞移植的裸鼠明显比NNMT干扰后的HT-29细胞移植的裸 鼠阳性要强(图8)。

实施例3：单克隆抗体应用于临床血清标本检测(采用双抗体夹心 法)

实施例1中1.5最终纯化的NNMT单克隆抗体可以应用于临床血清标 本中NNMT抗原的检测实验。我们选用Zj/2D8，1E7和2F8分离的单克隆抗 体对用血清稀释液(购自Prospec公司的NNMT抗原标准品(ENZ-418))稀 释的不同浓度标本进行NNMT抗原检测实验。先将单克隆抗体包被固相载 体，形成固相抗体，加入待检血清标本，形成固相抗原抗体复合物，再加 酶标单克隆抗体与复合物中的NNMT抗原结合，形成固相抗体-待测抗原- 酶标抗体夹心复合物，最后用底物显色剂显色。具体方法如下：

(1)包被：用包被缓冲液将NNMT抗体(分别将Zj/2D8，1E7和2F8 分离的单克隆抗体进行实验)稀释至10μg/mL，在每个聚苯乙烯板的反应 孔中加入0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次， 每次3分钟。

(2)加样：加待检血清样品0.1ml于上述已包被的反应孔中，放置37 ℃孵育1小时。然后洗涤3次。

(3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶 标记的NNMT抗体0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤3次。

(4)加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1ml，37℃， 15分钟。

(5)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05ml。

(6)用Elisa检测仪于450nm处测定OD值。

根据国外文献报道(Markus Roeβler,Wolfgang Rollinger,Stefan Palme, et al.Identification of Nicotinamide N-Methyltransferase as a Novel Serum  Tumor Marker for Colorectal Cancer,Clinical Cancer Research,2005)，使用 Elisa方法检测正常人血清中的NNMT抗原含量，最低者含量位于 169pg/ml，部分肿瘤患者血清浓度升高。所以，我们将NNMT抗原标准品 稀释成0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1ng/ml、5ng/ml， 10ng/ml和100ng/ml的浓度，检测结果如表4。

表4 Zj/2D8，1E7和2F8单克隆抗体检测不同NNMT抗原浓度的OD值

从结果中我们看到，Zj/2D8分离的单抗可以检测到50pg/ml，而1E7 和2F8检测到200pg/ml时已经分辨能力不强了。所以，Zj/2D8分离的单克 隆抗体适合制成各类试剂和试剂盒检测人血清中NNMT的浓度，对NNMT 抗原进行检测。