TLR配体对小鼠模型中HPV11E7CTL表位肽特异性免疫应答的调节作用

摘要

目的：
　　 1.研究尖锐湿疣皮损Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)各亚型的表达,以明确皮肤人乳头瘤病毒(HPV)感染高相关性TLR亚型。
　　 2.探讨TLR配体--咪喹莫特、PIC(polyinosinicacid:polycytidylic acid)以及CpG oligonucleotide对人乳头瘤病毒抗原肽-HPV11E7CTL表位肽(后简称“肽”)在小鼠模型中免疫应答的调节作用。
　　 方法：
　　 1.将尖锐湿疣病人的病损组织标本冰冻切片经免疫组化染色检测10种TLR亚型的表达情况,以正常皮肤组织作对照,比较两者TLRs表达谱的差异。
　　 2.提取小鼠骨髓树突状细胞(BM-DC),体外培养后先与HPV11E7CTL表位肽共孵育,再分别与咪喹莫特或PIC或CpG共孵育,以促进DC成熟,流式细胞仪检测孵育后DC表面标志改变;体内实验:将刺激成熟的DC分别注射于各组小鼠腹腔,以免疫小鼠,然后在小鼠皮下接种已转染HPV11E7基因的B16肿瘤细胞;体外实验:将HPV11E7CTL表位肽和TLR配体处理后的成熟DC与未经任何处理的小鼠脾细胞混合培养;ELISA法检测小鼠脾脏T淋巴细胞培养液中细胞因子TNF-α和IFN-γ的浓度;乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性;监测小鼠皮下肿瘤大小以观察DC免疫后对肿瘤的预防作用。
　　 结果：
　　 1.正常表皮角质层和颗粒层TLR6、9呈强阳性表达,TLR1、3、10呈中等度表达,TLR2、4、5、7、8弱表达,棘层和基底层细胞不表达或弱表达TLR;尖锐湿疣皮损表皮中除基底层弱表达或不表达TLR外,其余细胞层TLR1、3、6、9强阳性表达,TLR4、8、10中等度表达,TLR2、5、7弱表达。两组的真皮层均未见明显TLR阳性细胞。
　　 2.BM-DC经与HPV11E7CTL表位肽及TLR配体共孵育后,反映其成熟度的表面标志CD40、CD80、CD86)及MHCⅡ(I-Ak)表型均明显提高;肽加CpG处理组小鼠脾细胞分泌细胞因子TNF-α和IFN-γ的水平均为最高,且与对照组有明显差异(P＜0.05);各处理组小鼠肿瘤生长速度及脾脏T淋巴细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性与对照组未见明显差异。
　　 结论：
　　 1.尖锐湿疣皮损增生的角质形成细胞中TLR表达较正常皮肤明显增高,尤以TLR1、3、6、9亚型较显著,可能与HPV感染启动机体抗病毒免疫有关。
　　 2.TLR激动剂尤其是CpG对小鼠模型中HPV11E7CTL表位肽所致的特异性免疫应答具有上调作用。