TLR3激动剂poly(I:C)联合mORP150提高HPV16相关抗原表位肽E749-57抗肿瘤免疫的实验研究

摘要

目的：
　　 一、克隆、原核表达mORP150，亲和层析纯化目的蛋白mORP150，WestemBlot定性鉴定，为进一步研究该蛋白的功能奠定基础。
　　 二、研究mORP150蛋白是否能与HPV16抗原表位肽E749-57在体外非共价结合形成复合物；探讨联合运用mORP150和poly(I:C)分子佐剂能否协同提HPV16抗原表位肽E749-57的免疫原性，评估该疫苗设计策略的体内抗肿瘤效应。为HPV治疗性疫苗的研制提供参考方法。
　　 方法：
　　 一、用Trizol法从小鼠肝脏组织中提取总RNA，逆转录成cDNA，克隆出mORP150的cds编码区，经双酶切连接重组到原核表达载体pQE80L中，化学法转化大肠埃希菌Rosetta2(DE3)pLysS，IPTG诱导表达，亲和层析纯化mORP150蛋白，通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定该目的蛋白。
　　 二、体外热应激状态下与HPV16E749-57结合形成复合物，利用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的HPV16E749-57作为追踪剂，非变性凝胶电泳后莹光显影和考马斯亮监染色鉴定非共价结合。利用TLR3激动剂poly(I:C)联合mORP150-E749-57复合物免疫小鼠，MTT法检测小鼠脾细胞增值程度，LDH释放实验检测特异CTL;以TC-1细胞接种的C57BL/6小鼠为模型，比较各组对肿瘤生长和荷瘤小鼠生存时间的影响，评估该联合佐剂疫苗设计策略的体内诱发特异性杀伤能力和对肿瘤的治疗性作用。
　　 结果：
　　 一、成功克隆出mORP150cDNA，琼脂糖凝胶电泳可见3000bp处出现明显条带，连接入质粒载体后酶切鉴定正确，经DNA序列测定与Genebank中记录的mORP150cds-致，长度为3000bp；目的片段连入表达载体pQE80L，经测序验证其插入位点和插入方向完全止确。1mM的IPTG诱导表达，表达产物SDS-PAGE电泳，在150kDa附近出现明显条带；用抗鼠ORP150单克隆抗体作一抗，在目的大小处可见一清晰条带，证实该方法能成功表达mORP150。通过亲和层析纯化方法，可以有效纯化mORP150，纯化蛋白浓度达1mg/ml。
　　 二、摩尔比在50：1的条件下，mORP150能与FITC-E749-57进行结合反应，先在50℃的水浴里孵育30分钟，再至37℃水浴里至30分钟，非变性凝胶电泳后莹光显影和考马斯亮监染色证实在体外能形成稳定的mORP150-E749-57复合物。mORP150-E749-57复合物加poly(I:C)组、E749-57多肽加poly(I:C)组和mORP150-E749-57复合物组免疫小鼠脾淋巴细胞增值活性明显高于E749-57多肽组、mORP150组、poly(I：C)组和PBS组，增值指数达2．0以上；上述三组的脾细胞特异性杀伤率也显著比其他组高；相对其他免疫治疗组，poly(I:C)联合mORP150-E749-57复合物组能显著抑制小鼠肿瘤的增长和提高荷瘤小鼠的生存时间，与其他实验组相比，P＜O.05，具有统计学意义。
　　 结论：
　　 一、成功从小鼠肝脏组织中克隆出mORP150的cDNA，在原核细胞Rosseta2中能够得到大量表达，通过亲和层析纯化表达产物，能够得到均一条带的目的蛋白：热应激状态下，利用FITC作为追踪剂，可以间接证明该条件下mORP150能与HPV16E749-57在体外形成稳定的复合物。
　　 二、用poly(I：C)或者mORP150作为分子佐剂，均能提高抗原多肽HPV16E749-57的免疫原性，而poly(I：C)联合ORP150-E749-57复合物，能显著抑制小鼠肿瘤的增长和提高生存率，效果比单用mORP150或者poly(I:C)佐剂要强，提示联合佐剂能够更好的逾越荷瘤机体内的某些免疫耐受机制，为开发HPV感染治疗性疫苗提供了一种参考策略。